Verwendung von maschinellem Lernen zur Vorhersage von Proteinen

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13821 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Parasitäre Pilze produzieren Proteine, die die Virulenz modulieren, die Physiologie des Wirts verändern und Wirtsreaktionen auslösen. Diese Proteine, die als eine Art „Effektor“ klassifiziert werden, wirken häufig über Protein-Protein-Interaktionen (PPIs). Der Pilzparasit Ophiocordyceps camponoti-floridani (Zombieameisenpilz) manipuliert das Verhalten von Camponotus floridanus (Zimmermannsameise), um die Übertragung zu fördern. Der auffälligste Aspekt dieser Verhaltensänderung ist ein Phänotyp der Gipfelkrankheit, bei dem infizierte Wirte aufsteigen und sich an einer erhöhten Position festsetzen. Es ist plausibel, dass interspezifische PPI Aspekte der Ophiocordyceps-Infektion und Wirtsmanipulation beeinflussen. PPI-Vorhersagen durch maschinelles Lernen bieten Hochdurchsatzmethoden zur Erstellung mechanistischer Hypothesen darüber, wie diese Verhaltensmanipulation erfolgt. Mithilfe von D-SCRIPT zur Vorhersage von Wirt-Parasit-PPIs fanden wir ca. 6000 Interaktionen mit 2083 Wirtsproteinen und 129 Parasitenproteinen, die von Genen kodiert werden, die bei manipuliertem Verhalten hochreguliert werden. Wir haben bei diesen Proteinen mehrere Überrepräsentationen funktioneller Anmerkungen festgestellt. Die stärksten Signale im Wirt hoben neuromodulatorische G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und Oxidations-Reduktions-Prozesse hervor. Wir haben auch strukturelle und Genregulationsproteine ​​von Camponotus entdeckt. Im Parasiten fanden wir eine Anreicherung von Ophiocordyceps-Proteasen und eine häufige Beteiligung neuartiger kleiner sekretierter Proteine ​​mit unbekannten Funktionen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse liefern wir neue Hypothesen zu potenziellen Parasiteneffektoren und Wirtszielen, die der Verhaltensmanipulation von Zombieameisen zugrunde liegen.

Pilzparasiten nutzen eine Vielzahl abgesonderter Moleküle, um sich zu verteidigen, Infektionen zu fördern und ihre Wirte zu verändern. In bestimmten Fällen kann eine Infektion sogar zu einer parasitären Manipulation des Wirtsverhaltens führen. Sekretierte Pilzmoleküle, die oft als „Effektoren“ bezeichnet werden, spielen eine entscheidende Rolle in der Wirt-Parasit-Dynamik, die sowohl weit verbreitete als auch hochspezifische Mechanismen umfasst1,2,3,4. Es wurde vermutet, dass Parasiteneffektoren durch ihre Wechselwirkungen mit Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, Lipiden, kleinen Metaboliten und Proteinen des Wirts eine Schlüsselrolle bei der Infektion von Insekten durch entomopathogene Pilze spielen3,5,6,7. Die bioinformatische Erforschung der Effektorproteinbiologie bietet eine Hochdurchsatzmethode zur Entwicklung mechanistischer Hypothesen darüber, wie einige Parasiten das Verhalten ihrer Wirte verändern können. Hier verwenden wir solche Ansätze, um den verhaltensmanipulierenden Pilz Ophiocordyceps camponoti-floridani (Zombieameisenpilz aus Florida) und seinen Insektenwirt Camponotus floridanus (Zimmermannsameise aus Florida) zu untersuchen.

Myrmekophile Ophiocordyceps-Pilze sind typischerweise artspezifische Parasiten, die sich über Millionen von Jahren gemeinsam mit ihren Ameisenwirten entwickelt haben8. Diese enge Beziehung hat zu Interaktionen zwischen Pilzen und Ameisen geführt, die das Verhalten des Wirts auf eine Weise verändern, die für den Parasiten anpassungsfähig ist. Manipulierte Wirtsameisen erliegen einer Gipfelkrankheit, heften sich an erhöhte Positionen und sterben an Orten, die das Wachstum und die Übertragung von Pilzen fördern9,10,11,12,13. Zu den Verhaltensänderungen vor diesem letzten Gipfel könnten wirtsadaptive Reaktionen, parasitenadaptive Manipulationen oder allgemeine Krankheitssymptome gehören, die Hyperaktivität, unkoordinierte Nahrungssuche, verminderte Kommunikation zwischen Nestkameraden und Krämpfe umfassen9,14,15,16,17. Während diese veränderten Verhaltensweisen von Ameisen schon seit einiger Zeit in der Natur beobachtet werden18, handelt es sich bei der Erforschung der beteiligten Pilzeffektoren um relativ neue Bestrebungen14,19,20,21,22,23,24,25. Diese zahlreichen „-omics“-Studien lieferten Hypothesen über die Parasiten- und Wirtsmoleküle, die bei der Festlegung der beobachteten Verhaltensphänotypen eine Rolle spielen, lassen ihre möglichen Wechselwirkungen jedoch offen für Interpretationen.

An der Verhaltensmanipulation von Ophiocordyceps könnten eine große Anzahl von Pilzmolekülen und Ameisenpfaden beteiligt sein, darunter Neuromodulatoren und -schutzmittel, Insektenhormone, Nahrungsaufnahme, Fortbewegung, zirkadiane Rhythmen und Lichtwahrnehmung sowie Muskelhyperaktivität14,17,19,21,22 ,25,26,27,28,29. Pilzproteine ​​wie bakterienähnliche Enterotoxine, Protein-Tyrosinphosphatasen, Peptidasen (z. B. S8-Subtilisin-ähnliche Serinproteasen) und unbeschriebene kleine sezernierte Proteine ​​(uSSPs) wurden als Manipulationsmechanismen vorgeschlagen, die vermutlich durch PPIs funktionieren. Diese Hypothesen werden durch eine starke Gen-Hochregulierung dieser Kandidaten während der aktiven Manipulation der Ameise und genomische Vergleiche zwischen den Ophiocordyceps gestützt14,19,24. Zahlreiche andere dieser Proteine ​​werden ebenfalls als plausible Effektoren vermutet. Sie in vivo zu testen, wird ein kostspieliger und mühsamer Prozess in einem neuen, nicht traditionellen Modellorganismus wie O. camponoti-floridani sein. Neue Erkenntnisse, die zuvor vermutete Kandidatenproteine ​​und -wege mit Wirt-Parasit-Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) in Verbindung bringen, würden die Auswahl der besten Vorhersagen für die Funktionsvalidierung stark unterstützen.

Die Nutzung großer Datenmengen und rechnerischer Methoden zur Erforschung der Wirt-Parasit-Biologie ist eine kontinuierliche und vielschichtige Anstrengung. Dennoch gibt es nach wie vor nur begrenzte Beispiele für die Verwendung dieser Vermögenswerte bei der PPI-Vorhersage30,31. Die bioinformatische Vorhersage von PPIs im Proteommaßstab wurde größtenteils zur Beschreibung von Proteininteraktionsnetzwerken innerhalb eines einzelnen Organismus eingesetzt, wie dies auch für die Wirtsspezies C. floridanus 32 der Fall war. Es wurden jedoch PPI-Vorhersagen für einige interspezifische Wirt-Parasit-Beziehungen gemacht, darunter tierische oder pflanzliche Wirte sowie bakterielle, virale oder pilzliche Parasiten33,34,35,36. Die Vorhersage von PPIs erfolgt in der Regel mithilfe einer Interolog-Methode oder einer Methode des maschinellen Lernens. Interologe sind orthologe Interaktionen, die artenübergreifend erhalten bleiben; Jedes Protein in einem PPI hat Orthologe im zweiten PPI37. Die Erkennung eines Interologen in einem neuen System ist zwar ein nützliches Vorhersagetool, erfordert jedoch etablierte Referenz-PPIs aus anderen Systemen. Diese Einschränkung durch die verfügbaren Daten würde bei der Analyse von Wechselwirkungen zwischen Nicht-Modellorganismen zu einer sehr begrenzten Anzahl von Vorhersagen führen. Eine flexiblere Alternative bieten Methoden des maschinellen Lernens. Insbesondere Deep-Learning-Tools für neuronale Netze für die PPI-Vorhersage sind in den letzten Jahren zunehmend verfügbar geworden und stellen weiterhin ein aktives Entwicklungsfeld dar38,39,40,41. Hier basieren die vorhergesagten PPIs immer noch auf einem bekannten Satz von PPIs, die für Trainingsdaten verwendet werden. Sobald das Programm jedoch trainiert ist, ist es in der Lage, neuartige Interaktionen außerhalb des ursprünglichen Datensatzes vorherzusagen35,42. Das Deep-Learning-Tool D-SCRIPT hat eine ungewöhnliche Flexibilität bei artenübergreifenden PPI-Vorhersagen gezeigt, wenn es an einem Organismus trainiert, aber an einer anderen Art getestet wurde35. Proteineinbettungen, die mutmaßliche Strukturinformationen kodieren, werden zum Trainieren von D-SCRIPT-Modellen verwendet, die vorhergesagte Protein-Protein-Kontaktkarten erstellt haben, die weitgehend mit experimentell gemessenen angedockten Proteinen übereinstimmen35,36,43. Obwohl andere Methoden des maschinellen Lernens D-SCRIPT in Kontexten derselben Spezies übertreffen können, ist die speziesübergreifende Generalisierbarkeit der Vorhersagekraft von D-SCRIPT ein wichtiger Schritt für die Forschung an Nicht-Modell- oder Mehrspezies-Systemen35,38. Insbesondere Ophiocordyceps und andere Pilze sezernieren eine Reihe taxonomisch unterschiedlicher uSSPs, von denen oft angenommen wird, dass sie Effektoren bei Wirt-Parasit-Interaktionen sind14,19,24,44,45,46. Daher können bioinformatische Techniken, die auf gut beschriebenen Proteinanmerkungen basieren oder starken artspezifischen Verzerrungen unterliegen, nur begrenzten Erfolg bei der Zuordnung von uSSPs zu PPIs haben.

Für unsere Analysen zwischen O. camponoti-floridani- und C. floridanus-Proteinen verankern wir unsere Berichterstattung über funktionelle Anreicherungen auf Gruppenebene vorhergesagter positiver PPIs. Wir haben diesen Ansatz unter Berücksichtigung der gemeldeten Fehlerraten des D-SCRIPT-Standardmodells für Insektenarten (Drosophila) und Pilzarten (Saccharomyces) gewählt. In diesen Tests enthielten die vorhergesagten positiven PPIs 71–79 % richtig positive Ergebnisse (Präzisionsrate) und erfassten 22–36 % aller richtig positiven Ergebnisse (Erinnerungsrate)35, was darauf hindeutet, dass dieses Tool bei breiten Charakterisierungen am stärksten ist und nicht bei der Validierung spezifischer, zuvor angenommene PPIs. In ähnlicher Weise haben wir D-SCRIPT anhand experimentell bestätigter interspezifischer PPIs zwischen Pilzen und Tieren verglichen und einen vergleichbar niedrigen True-Positive-Recall bei gleichzeitig höherer Präzision festgestellt. Die Autoren von D-SCRIPT haben auch vorgeschlagen, dass dieses Tool eine frühere Deep-Learning-Methode bei der Reproduktion von Genontologie-(GO)-Begriffsanreicherungen experimentell identifizierter Virus-Mensch-PPIs übertreffen kann35.

Wir verwendeten D-SCRIPT, um mögliche PPIs von O. camponoti-floridani und C. floridanus vorherzusagen, die an Verhaltensmanipulationen beteiligt sind. Wir haben diese Vorhersagen in Teilmengen gefiltert, von denen wir annahmen, dass sie am wahrscheinlichsten relevante Interaktionen beinhalten. Daher konzentriert sich unsere Studie auf PPIs, an denen mutmaßlich sezernierte O. camponoti-floridani-Proteine ​​beteiligt sind, die von Genen kodiert werden, von denen zuvor festgestellt wurde, dass sie während manipulierter Gipfelbesteigung hochreguliert werden19. Diese Pilzproteine ​​werden während der Manipulation plausibel in die Wirtsumgebung exportiert, was Hypothesen stützt, die solche Proteine ​​mit der Manipulation des Wirtsverhaltens in Verbindung bringen.

Wir beleuchten Aspekte funktioneller Anreicherungen nach dem Herausfiltern von Camponotus-Proteininteraktionen mit Pilzen, die diesen Wirt auf natürliche Weise nicht infizieren oder manipulieren („aspezifische“ Pilze). Diese aspezifischen Pilze decken unterschiedliche Lebensstile und phylogenetische Beziehungen zu Ophiocordyceps ab: (i) Cordyceps bassiana (d. h. Beauveria bassiana), ein generalistischer Entomopathogen in der Ordnung Hypocreales (zu der auch Ophiocordyceps gehören), (ii) Trichoderma reesei, ein pflanzenabbauender Saprophyt in der Ordnung Ordnung Hypocreales (obwohl die Gattung auch Entomopathogene umfasst) und (iii) Saccharomyces cerevisiae, eine phylogenetisch entfernte saprophytische Hefe in der Ordnung Saccharomycetales mit einem kleineren Sekretom. Dieser Ansatz rückte die einzigartigen Ophiocordyceps-PPIs in den Vordergrund, lässt die aspezifischen Vorhersagen jedoch nicht außer Acht. Vielmehr lenkt es zusätzliche Aufmerksamkeit auf eine engere Gruppe spezifischer PPIs, die gemeinsam entwickelte Anpassungen umfassen könnten, die dem durch Ophiocordyceps manipulierten Camponotus-Verhalten zugrunde liegen.

Die Host-Pathogen Interaction Database (Version 3.0) stellte experimentell bestätigte PPIs zwischen 5 Pilz- und 12 Tierarten bereit. Wir haben diese Daten verwendet, um D-SCRIPT bei der Vorhersage interspezifischer PPIs zu vergleichen. Die von uns ausgewählten Arten der experimentellen Unterstützung umfassten direkte Interaktionen und Reaktionen (z. B. „Phosphorylierungsreaktion“), schlossen jedoch Assoziationen, Kolokalisationen und genetische Effekte (z. B. „additive genetische Interaktion“) aus. Aus rechnerischen Gründen haben wir nur PPIs mit Proteinen ≤ 2000 Aminosäuren einbezogen. Wir haben ähnliche PPIs weiter darauf beschränkt, nur eine repräsentative Interaktion einzuschließen, indem wir alle Proteine ​​im Datensatz mithilfe von MMseqs2 (v. 9-d36de) mit einer Ähnlichkeit von 40 % geclustert haben (Einzelschritt-Easy-Clustering mit minimaler Sequenzidentität 0,4)47. Für alle PPIs, die dieselben zwei homologen Proteincluster verbanden, haben wir zufällig einen dieser PPIs ausgewählt und die anderen entfernt. Insgesamt entstanden so 567 experimentell verifizierte Pilz-Tier-PPIs.

Zusätzlich zu diesen verifizierten, positiven Pilz-Tier-PPIs haben wir eine Reihe negativer Wechselwirkungen erstellt, die bei der Bewertung von D-SCRIPT verwendet werden. Zuvor wurden in D-SCRIPT-Auswertungsdatensätzen zufällig gepaarte Proteine ​​des getesteten Organismus als negative PPI-Beispiele verwendet35. In diesem Sinne haben wir künstliche interspezifische Pilz-Tier-PPIs unter Verwendung zufälliger Hefe- (S. cerevisiae) und Fliegenproteine ​​(Drosophila melanogaster) erstellt, die aus der STRING-Datenbank (Version 11.0)48 gesammelt wurden. Anstatt Proteine ​​aller Organismen im Pilz-Tier-Datensatz zufällig zu paaren, haben wir diese beiden Organismen ausgewählt, weil sie beide: (i) in den positiven PPIs vertreten waren, (ii) über robuste PPI-Daten verfügten, um bekannte positive Wechselwirkungen aus dem Zufallsprinzip zu entfernen Paarungen, (iii) wurden in den ursprünglichen D-SCRIPT-Bewertungen verwendet und (iv) stimmen mit Ophiocordyceps und Camponotus als Pilz-Insekten-Paar überein35. Mithilfe der oben genannten 40 %-Clustering-Methode haben wir alle zufälligen Hefe-Fliegen-PPIs herausgefiltert, die positiven Pilz-Tier-Interaktionen ähnelten. Wir haben auch alle entfernt, die bekannten, hochsicheren, experimentell bestätigten Fliegen- oder Hefe-PPIs ähnelten, die in der STRING-Datenbank aufgeführt sind („Experiment-Score“ > 0 und „kombinierter Score“ ≥ 700)48. Dann haben wir nur einen Vertreter von PPIs behalten, die einander ähnlich waren. Nach dem Filtern haben wir 5670 zufällige PPIs (das Zehnfache der Anzahl positiver Fälle) ausgewählt, um sie als negative Beispiele im Bewertungsdatensatz zu verwenden.

Wir verwendeten D-SCRIPT (Version 0.1.5) mit dem vorab trainierten Standardmodell für menschliches Protein und Einstellungen im Bewertungsmodus mit diesem Pilz-Tier-Datensatz (567 positive und 5670 negative PPIs)35. D-SCRIPT weist jeder getesteten Proteininteraktion einen Kantenwert zu (d. h. einen Konfidenzwert zur Einstufung möglicher PPIs) mit einem Standardschwellenwert für eine positive Vorhersage von ≥ 0,5 auf einer Skala von null bis eins. Diese Parameter wurden zuvor zur Vorhersage von PPIs in Fliegen und Hefen verwendet35.

Um PPIs zwischen sekretierten Proteinen von O. camponoti-floridani und Proteinen von C. floridanus vorherzusagen, haben wir Sequenzinformationen für beide Organismen aus hochwertigen Genomassemblierungen abgerufen, die Long-Read-Technologie integrieren (GenBank-Zugänge GCA_012980515.1 bzw. GCA_003227725.1)19, 49. Für Camponotus-Proteine ​​haben wir die Sequenz verwendet, die durch die längste Isoform dargestellt wird (n = 12.512). Durch die Kombination von acht Annotationstools (SignalP v6.0, TMHMM, Phobius, Prosite, PredGPI, NucPred und TargetP v2.0) haben wir eine Lokalisierung von Ophiocordyceps-Proteinen außerhalb der Zelle vorhergesagt50,51,52,53,54,55 ,56 nach den relativ konservativen Ansätzen von Beckerson et al.1. Wir haben uns in unseren nachgelagerten Analysen auf sekretierte Proteine ​​(n = 586) konzentriert und Transmembranproteine ​​(n = 1301) ausgeschlossen, da wir der Ansicht waren, dass diese Effektoren am plausibelsten darstellen. Darüber hinaus zeigten unsere vorläufigen Ergebnisse, dass Transmembranproteine ​​​​im Allgemeinen weniger spezifisch in ihrer Bindung waren (Ergänzende Diskussion S1). Alle verbleibenden nicht sezernierten, nicht transmembranösen Proteine ​​wurden als intrazellulär angesehen (n = 5568). Wir haben sekretierte Proteine ​​als uSSPs gekennzeichnet, wenn sie weniger als 300 Aminosäuren lang waren und keine BLAST-Beschreibung, keinen GO-Begriff oder keine PFAM-Domäne enthielten (n = 154)19. Aus rechnerischen Gründen haben wir Proteine ​​mit ≤ 2000 Aminosäuren verwendet. Durch die Begrenzung der Länge der Input-Proteine ​​wurden 63 (1,1 %) intrazelluläre Ophiocordyceps-Proteine ​​und 299 Camponotus-Proteine ​​(2,4 %) entfernt.

Wir haben D-SCRIPT (Version 0.1.5) im Vorhersagemodus mit dem vorab trainierten Standardmodell und den Einstellungen für menschliches Protein verwendet, um PPIs vorherzusagen (wie oben für das Pilz-Tier-Benchmarking)35. Wir haben jede PPI-Kombination zwischen sekretierten O. camponoti-floridani-Proteinen und dem gesamten C. floridanus-Proteom getestet (Abb. 1, Schritt 1).

Konzeptioneller Rahmen für PPI-Tests, -Auswahl und -Analyse. Schritt 1) ​​Wir haben jedes sekretierte O. camponoti-floridani-Protein (Sekretom) mit jedem C. floridanus-Wirtsprotein (Proteom) getestet. Schritte 2, 3) Wenn ein interspezifischer PPI und ein Ophiocordyceps-Selbstinteraktions-PPI ein gemeinsames Pilzprotein gepaart mit einem zwischen beiden Arten homologen Protein hatten, haben wir diesen PPI aus unseren Vorhersagen entfernt. Schritt 4) Anschließend haben wir die vorhergesagten PPIs gefiltert, um uns auf diejenigen zu konzentrieren, an denen Pilzproteine ​​beteiligt waren, die von Genen kodiert wurden, die während der Manipulation hochreguliert wurden. Schritt 5) Wir analysierten Wirts- und Parasitenproteine ​​dieser PPIs mit hypergeometrischen Anreicherungsanalysen. Für Anreicherungsanalysen war der Hintergrundproteinsatz entweder das Sekretom des Parasiten (Ophiocordyceps) oder das Proteom des Wirts (Camponotus). Schritt 6) Wir führten auch Anreicherungsanalysen durch, nachdem wir PPIs oder Wirtsproteine ​​entfernt hatten, die bei Interaktionen zwischen aspezifischen Pilzen und C. floridanus vorhergesagt wurden. Pilzproteine ​​werden als Kreise und Ameisenproteine ​​als Quadrate dargestellt. Die Proteine ​​sind farblich gekennzeichnet, wobei die hochregulierten, sekretierten Proteine ​​von Ophiocordyceps in interspezifischen PPIs in Rot und ihre interagierenden Camponotus-Proteine ​​in leuchtendem Blau dargestellt sind. Orangetöne stellen andere abgesonderte Pilzproteinkategorien dar, während Blaugrau auf andere Wirtsproteine ​​in PPIs hinweist. Alle anderen Proteine ​​sind grau dargestellt. Proteine ​​„A“ sind Homologe von Ophiocordyceps und Camponotus, und Protein „B“ ist ein einzelnes Pilzprotein.

Um selbstinteragierende Ophiocordyceps-PPIs zu identifizieren, testeten wir sekretierte Ophiocordyceps-Proteine ​​gegen intrazelluläre Ophiocordyceps-Proteine ​​(Abb. 1, Schritt 2). Anschließend identifizierten wir reziproke Homologe (mutmaßliche Orthologe) zwischen Ophiocordyceps- und Camponotus-Proteinen unter Verwendung von Proteinortho (Version 5.0) mit Standardeinstellungen57. Wir haben PPIs herausgefiltert, die ein vom Pilz sezerniertes Protein enthielten, von dem vorhergesagt wurde, dass es sowohl eines der eigenen intrazellulären Proteine ​​von Ophiocordyceps als auch ein Camponotus-Protein bindet, das zu diesem intrazellulären Pilzprotein ortholog war (Abb. 1, Schritt 3). Wir kamen zu dem Schluss, dass ein interspezifischer PPI eher auf eine Interaktion im Zusammenhang mit einer Infektion oder Manipulation hinweisen würde, wenn vorhergesagt wurde, dass das Ophiocordyceps-Protein nur ein Camponotus-Protein bindet, ohne auch ein Pilzortholog an dieses Ameisenprotein zu binden. Wir hielten dies für einen vorteilhaften Kompromiss, da wir möglicherweise Parasiteneffektoren außer Acht ließen, die möglicherweise auf gut konservierte biologische Prozesse abzielen.

Wir haben die verbleibenden PPIs auf solche eingegrenzt, an denen sekretierte Pilzproteine ​​beteiligt sind, die von differentiell exprimierten Genen (DEGs) kodiert werden (Abb. 1, Schritt 4). Diese Gene wurden während des manipulierten Gipfelverhaltens bei C. floridanus-Ameisen, die experimentell mit O. camponoti-floridani infiziert waren, im Vergleich zu ihrer Expression in Kultur hochreguliert19. Durch die Einbeziehung empirischer Genexpressionsdaten haben wir unsere rechnerischen Analysen in Vorhersagen verankert, die während der Manipulation biologisch am relevantesten sind. Obwohl die Möglichkeit besteht, dass einige Parasiteneffektoren während der Manipulation ohne erhöhte Gentranskription wirken, gingen wir davon aus, dass die Genexpression in den meisten Fällen informativ wäre.

Wir führten hypergeometrische Anreicherungsanalysen an Proteinen aus PPIs mit sekretierten, hochregulierten Ophiocordyceps-Proteinen durch, die nur vorhergesagte Wechselwirkungen mit dem Wirt aufwiesen. Für Anreicherungsanalysen der Pilzproteine ​​in diesen PPIs verwendeten wir das Sekretom von O. camponoti-floridani als Hintergrund. Für Anreicherungsanalysen der Ameisenproteine ​​in diesen PPIs verwendeten wir das Proteom von C. floridanus als Hintergrund (Abb. 1, Schritt 5).

Wir untersuchten annotierte GO-Begriffe (biologische Prozesse und molekulare Funktionen kombiniert)58, PFAM-Domänen59 und Modulmitgliedschaften der gewichteten Gen-Koexpressionsnetzwerkanalyse (WGCNA)60, die in der Transkriptomik-Studie gemeldet wurden, aus der wir auch die oben genannten DEGs19 erhielten. Diese WGCNA-Module korrelierten die Expression von Gennetzwerken mit den Probentypen in dieser Studie, d. h. (i) gesunde Ameisenkontrollen, (ii) In-vitro-Pilzkontrollen, (iii) durch aktive Pilze manipulierte Ameisen und (iv) durch sterbende Pilze manipulierte Ameisen Ameisen. Diese Module korrelierten zusätzlich direkt zwischen Ophiocordyceps-Genmodulen und Camponotus-Genmodulen19. Wir haben ihre zuvor zugewiesenen Namen gemäß der in dieser Studie verwendeten Konvention „ant-module-1“ (A1) und „fungus-module-1“ (F1) referenziert19. Für Camponotus-Proteine ​​haben wir auch Anreicherungen der DEG-Klasse getestet (d. h. hochregulierte oder herunterregulierte Genexpression von gesunden Kontrollpersonen bis hin zu aktiv manipulierten Ameisen)19. Für Ophiocordyceps-Proteine ​​haben wir zusätzlich die Anreicherung von uSSP-Annotationen getestet.

Wir haben die hypergeometrischen Anreicherungsanalysen mit dem R-Paket timecourseRNAseq (Version 0.0.9000) unter Verwendung der Standardeinstellungen (signifikante Anreicherung bei FDR ≤ 0,05) in R Studio (Version 2021.09.2) mit R (Version 4.1)61,62,63 durchgeführt. Wir haben GO-Begriffe im semantischen Raum dargestellt, um verwandte Begriffe basierend auf dem von REVIGO generierten R-Code zu gruppieren, haben jedoch keine GO-Begriffe entfernt (R-Paket ggplot2, Version 3.3.5)64,65.

Für selektivere Analysen artspezifischer Ophiocordyceps-Camponotus-PPIs haben wir aspezifische PPIs aus den Sekretomen anderer Pilze hergestellt, die gegen das C. floridanus-Proteom getestet wurden. Durch die Entfernung häufiger vorkommender PPIs, so dass nur diejenigen übrig blieben, die möglicherweise nur bei Ophiocordyceps vorkommen, ergab sich eine Sichtweise, die im Kontext spezieller Parasiten-Wirt-Interaktionen, wie z. B. Verhaltensmanipulation, leichter zu interpretieren war. Um relevant zu sein, muss ein PPI jedoch nicht eindeutig für eine bestimmte interspezifische Interaktion gelten1. Darüber hinaus weist die rechnerisch vorhergesagte Proteinbindung nicht darauf hin, dass alle derartigen Wechselwirkungen in dynamischen physiologischen Umgebungen stattfinden. In und um die Zelle herum können Proteinlokalisierung, Transkriptionskontrolle, posttranslationale Modifikation, konkurrierende PPIs und biochemische Bedingungen (z. B. pH-Wert) die Wahrscheinlichkeit des Auftretens eines vorhergesagten PPI beeinflussen. Die Zellumgebungen in Pilzzellen und Insektenzellen könnten sich plausibel in vielerlei Hinsicht unterscheiden und die Proteinaktivität beeinflussen. Daher nutzten wir die Entfernung aspezifischer Interaktionen, um uns auf einige der wahrscheinlich wichtigeren PPIs zu konzentrieren, die an der Etablierung der Ophiocordyceps-Manipulation des Ameisenverhaltens beteiligt sind, verankerten unsere Analysen und Diskussionen jedoch weiterhin auf dem größeren Datensatz.

Wir haben drei Pilze basierend auf Lebensstil, Phylogenie und Verfügbarkeit gut annotierter Genome ausgewählt, um aspezifische PPIs zu generieren: C. bassiana (GenBank-Zugang GCA_000280675.1), T. reesei (GenBank-Zugang GCA_000167675.2) und S. cerevisiae (GenBank Beitritt GCF_000146045.2)7,66,67. Was Ophiocordyceps betrifft (siehe oben), haben wir jedes Pilzsekretom vorhergesagt und sekretierte Proteine ​​mit einer Länge von über 2000 Aminosäuren entfernt, wodurch nur ein T. reesei-Protein (0,002 %) entfernt wurde. Die Sekretome der Pilze C. bassiana, T. reesei und S. cerevisiae umfassten 833, 505 bzw. 153 Proteine. Diese Proteine ​​wurden dann für D-SCRIPT-Vorhersagen mit dem Camponotus-Proteom gepaart (siehe oben).

Um orthologe Proteine ​​zwischen Ophiocordyceps und jedem der aspezifischen Pilze zu finden, verwendeten wir Proteinortho (Version 6.0) mit Standardeinstellungen und erzwangen gleichzeitig Blastp + und einzelne beste reziproke Treffer (dh -sim = 1)57. Anhand dieser Informationen identifizierten wir gemeinsame PPIs zwischen Ophiocordyceps und Camponotus sowie aspezifischen Pilzen und Camponotus; dh Wechselwirkungen zwischen orthologen Pilzproteinen und demselben Ameisenprotein (ergänzende Abbildung S1). Genauer gesagt haben wir auch einen Filter angewendet, der gemeinsame Wirtsproteine ​​mit aspezifischen Pilzinteraktionen unabhängig von der Orthologie eliminiert. Dies führte zu einer Reihe von Ophiocordyceps-PPIs, bei denen das Camponotus-Protein in keinem aspezifischen PPI vorhergesagt wurde (ergänzende Abbildung S1). Nachdem wir entweder gemeinsam genutzte PPIs oder gemeinsam genutzte Wirtsproteine ​​entfernt hatten, führten wir erneut Anreicherungsanalysen durch (siehe oben), um überrepräsentierte Annotationen unter den Ophiocordyceps-spezifischen PPIs zu untersuchen (Abb. 1, Schritt 6). Um Veränderungen in der PPI-Konnektivität und -Häufigkeit zu visualisieren, die sich aus diesen aspezifischen Filtern ergaben, verwendeten wir Cytoscape (Version 3.8.2), um Netzwerke aus Wirtsproteinen und ihren jeweiligen Ophiocordyceps-Bindungspartnern zu erstellen68.

Um die Leistung von D-SCRIPT bei der Vorhersage interspezifischer PPIs zwischen Pilzen und Tieren zu bewerten, verwendeten wir experimentell unterstützte Interaktionen aus der Host-Pathogen Interaction Database69. Unser Auswertungsdatensatz umfasste 567 dieser verifizierten, positiven Wechselwirkungen aus einer Vielzahl von Pilz- und Tierarten. Wir kombinierten diese mit einem zehnfach negativen Hintergrund (5670 PPIs), der durch zufällige Paarung von Pilzproteinen (S. cerevisiae) und Insektenproteinen (D. melanogaster) erstellt wurde. Für diese Auswertung mit Testdaten im Verhältnis 1 positiv:10 negativ hat die Modellleistungsmetrik, Fläche unter der Präzisionsrückrufkurve (AUPR), einen Basiswert von 0,091. D-SCRIPT liefert Ergebnisse, die deutlich über diesem Wert liegen, wenn es um nur Fliegen35, nur Hefe35 und diese Pilz-Tier-Daten geht (AUPR 0,552, 0,405 bzw. 0,373) (Tabelle 1). Obwohl die Vorhersage interspezifischer Interaktionen tatsächlich schwierig zu sein scheint, deuten unsere Benchmarking-Daten (Tabelle 1) darauf hin, dass D-SCRIPT immer noch aussagekräftige Erkenntnisse in interspezifischen Kontexten liefert.

Wir haben insgesamt 7.156.818 potenzielle interspezifische PPIs zwischen dem Sekretom des Parasiten und dem Proteom des Wirts getestet (Abb. 1, Schritt 1). Von diesen möglichen Protein-Protein-Kombinationen wurden 0,33 % positiv als PPI vorhergesagt (n = 23.629 PPI) (Tabelle 2, ergänzende Abbildung S2). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit einer früheren positiven D-SCRIPT-Vorhersagerate von 0,95 % aus einem Datensatz einer einzelnen Art, der 50 Millionen potenzielle PPIs testete35.

Aus diesen positiv vorhergesagten interspezifischen Wechselwirkungen haben wir 2850 PPIs entfernt, die zu Wechselwirkungen innerhalb von Ophiocordyceps homolog waren (Abb. 1, Schritte 2 und 3, Tabelle 2). Anschließend haben wir diejenigen ausgewählt, an denen Ophiocordyceps-Proteine ​​beteiligt sind, die während der Manipulation von hochregulierten DEGs kodiert werden. Dies führte zu 6011 vorhergesagten PPIs. Wir haben diesen Satz mutmaßlicher Effektor-Wirt-PPIs, der 129 einzigartige Ophiocordyceps-Proteine ​​und 2083 einzigartige Camponotus-Proteine ​​enthält, für weitere Analysen verwendet (Abb. 1, Schritt 4, Tabelle 2, Ergänzungsdatei S1).

Die Anteile positiver PPI-Vorhersagen zwischen aspezifischen Pilzen und C. floridanus (Bereich 0,26–0,28 %) und sekretierten Proteinen, von denen vorhergesagt wurde, dass sie in mindestens einem PPI enthalten sind (Bereich 68–76 %), waren ähnlich den für Ophiocordyceps beobachteten Werten (0,33 % und). 69 % (jeweils 69 %) (Tabelle 2, Ergänzungstabelle S1). Durch die Eliminierung orthologer PPIs zwischen Ophiocordyceps und einem der aspezifischen Pilze (dh gemeinsamen PPIs) wurden 1776 der 6011 (30 %) Ophiocordyceps-Camponotus-PPIs entfernt (Tabelle 3, ergänzende Abbildung S1). Durch die Eliminierung von PPIs, an denen Wirtsproteine ​​beteiligt sind, von denen vorhergesagt wurde, dass sie auch von aspezifischen Pilzen gebunden werden, unabhängig von der Orthologie des Pilzbindungspartners (d. h. gemeinsam genutzte Wirtsproteine), wurden 1936 von 2083 (93 %) Wirtsproteinen entfernt, sodass nur 157 Ophiocordyceps-Camponotus-PPIs übrig blieben (3%) (Tabelle 3, ergänzende Abbildung S1). In Übereinstimmung mit der Sekretomgröße, der Phylogenie und dem entomopathogenen Lebensstil wies C. bassiana die größte Überschneidung mit den Vorhersagen von Ophiocordyceps auf (ergänzende Abbildung S1). Wie erwartet führte das Entfernen von PPIs, an denen gemeinsam genutzte Wirtsproteine ​​beteiligt waren, zu erheblichen Änderungen der Anreicherungsergebnisse, während das Entfernen gemeinsam genutzter PPIs zu geringfügigeren Änderungen führte (Tabelle 3, Ergänzungsdatei S2). Wir berichten hauptsächlich über die Ergebnisse, die auf allen drei Pilzen basieren, die wir in diese Studie einbezogen haben. Diejenigen, die nur auf C. bassiana basierten, waren jedoch weitgehend ähnlich (Ergänzungsdatei S1, Ergänzungsdatei S2). Während uns diese Filter beim Ordnen und Hervorheben der Ergebnisse halfen (dh Signale, die durch die strengsten Filter erhalten bleiben, werden priorisiert), haben wir diesen Ansatz nicht verwendet, um die interessierenden PPIs vollständig auszuwählen. Die unten dargestellten Ergebnisse verwenden nur dort, wo angegeben, spezifische Filter.

Wir fanden heraus, dass Ophiocordyceps-Proteine ​​in PPIs mit Camponotus-Proteinen für eine PFAM-Domäne und drei WGCNA-Module angereichert waren (Abb. 2, Tabelle 3).

Erweiterte WGCNA-Module und ihre Korrelationen zur Manipulation und untereinander. Modulmitgliedschaft, Korrelationen und funktionale Zusammenfassung der Module basierten auf früheren Arbeiten 19. Jedes Modul ist ein sich gegenseitig ausschließendes Netzwerk von Genen, die unter Kontroll-, manipulierten Ameisen- und sterbenden Ameisenbedingungen koexprimiert werden. Hier stellen wir nur Module dar, die zwischen PPIs angereichert sind, und nur deren Korrelationen zum manipulierten Zustand oder direkt zwischen Wirt-Parasit-Modulen. Das Modul F3 der Kernzellprozesse korrelierte eindeutig negativ mit den Kontrollbedingungen, wobei sich mäßige positive Korrelationen sowohl zwischen lebenden Manipulationen als auch sterbenden Ameisen aufteilten 19, wie hier durch „+“ angezeigt. Während die Module F1 und F3 auch deutlich mit dem neuronalen Prozessmodul A15 korrelierten, ist dieses Ameisenmodul hier nicht dargestellt, da es unter den in dieser Studie nachgewiesenen PPIs nicht angereichert war.

Bei der angereicherten PFAM-Domäne handelte es sich um eine „Peptidase-S8-Domäne“, was auf eine Überrepräsentation von Pilz-Serinproteasen hinweist, die Wirtsproteine ​​spalten könnten. Es wurde vorhergesagt, dass die fünf Pilzpeptidase-S8-Proteine ​​in dieser Anreicherung mit 34 Wirtsproteinen über 39 PPIs hinweg interagieren (Supplementary File S1). Unter diesen Wirtsproteinen befanden sich sieben Kinesin-ähnliche Proteine ​​(Motorproteine), fünf Kernporenproteine ​​und ein (Pro-)Resilin, bei dem es sich um ein Insektenkutikula- und Bindegewebsprotein handelt70. Auch nach der Entfernung von PPIs, die mit aspezifischen Pilzen geteilt wurden, blieb das Anreicherungssignal für S8-Peptidasen erhalten. Die viel strengere Entfernung gemeinsamer Wirtsziele machte jedoch das Ergebnis der S8-Peptidase-Anreicherung zunichte (Abb. 1, Schritt 6, Tabelle 3).

Wir fanden, dass die Pilz-WGCNA-Module F1, F2 und F3 angereichert waren (Abb. 2). Wir haben zuvor berichtet, dass die Module F1 und F2 signifikante positive Korrelationen zur Manipulation aufweisen. Dies bedeutet, dass die meisten Pilzgene in diesen Modulen während des manipulierten Gipfelverhaltens in ähnlicher Weise koexprimiert wurden. Daher enthielten diese Module mehrere Gene, von denen angenommen wurde, dass sie Infektions- oder Manipulationsprozesse vermitteln („uSSPs und hypothetische Effektoren“-Module) (Abb. 2). Da die Genexpression von Pilzen eindeutig negativ mit Kontrollkulturen korrelierte, korrelierte Modul F3 leicht positiv mit Pilzen sowohl in manipulierten als auch in sterbenden Wirten. Dieses Modul enthielt größtenteils Gene, die mit „Kernzellprozessen“ im Pilz zusammenhängen (z. B. DNA-Verpackung) (Abb. 2). Alle drei Pilzmodule wiesen auch signifikante direkte Korrelationen zu WGCNA-Modulen von Ameisen auf, wobei F1 negativ mit den Ameisenmodulen A14 und A15 korrelierte – beide sind mit neuronalen Prozessen des Wirts verbunden (Abb. 2). Das Kernzellprozessmodul F3 korrelierte positiv mit dem neuronalen Prozessmodul A1519. Die Überrepräsentationen aller drei Pilz-WGCNA-Module blieben nach der Eliminierung gemeinsamer PPIs erhalten, das uSSP- und Effektormodul F1 ging jedoch nach der Entfernung gemeinsamer Wirtsproteine ​​verloren (Tabelle 3).

Wir fanden heraus, dass Camponotus-PPI-Proteine ​​mit 50 GO-Termen, 74 PFAM-Domänen und neun WGCNA-Modulen angereichert waren (Tabelle 3). Da Anreicherungen von GO-Termen und PFAM-Domänen häufig auf ähnliche Funktionen hindeuteten, präsentieren wir die Ergebnisse größtenteils aus der Perspektive der GO-Terme. Wir heben PFAM-Domänen hervor, um sie hervorzuheben oder um biologisch interessante Ergebnisse zu diskutieren, die durch GO-Begriffe allein nicht gut erfasst werden können.

Wir haben Anreicherungen von GO-Termen für „G-Protein-gekoppelte Rezeptoraktivität (GPCR)“ und „GPCR-Signalweg“ festgestellt (Abb. 3). Diese Anreicherungen resultierten aus 71 GPCR-bezogenen PPIs mit 16 einzigartigen Ophiocordyceps-Proteinen (Supplementary File S1). Alle bis auf zwei Rezeptorproteine ​​in diesen PPIs trugen die PFAM-Domäne „7 Transmembranrezeptor (Rhodopsinfamilie)“. Wir fanden 33 einzigartige GPCR-bezogene Proteingene (von 128 möglichen mit diesen GO-Begriffen) mit einer Reihe mutmaßlicher Liganden: 11 Neuropeptide (n = 12 Rezeptoren), vier biogene Monoamine (Dopamin, Serotonin, Octopamin, Tyramin) (n = 11 Rezeptoren), Acetylcholin (n = 2 Rezeptoren), ein Spinnengifttoxinprotein (Alpha-Latrotoxin) (n = 1 Rezeptor) und Opsin-Blau- und Ultraviolett-empfindliche Rezeptoren (n = 2 Rezeptoren). Vierzehn dieser 33 Camponotus-Rezeptoren (oder Rezeptoruntereinheiten) gehörten zu den WGCNA-Modulen A14 und A15 der antneuronalen Prozesse, die im Vergleich zu gesunden Ameisen insgesamt eine verringerte Expression während der Manipulation zeigten (d. h. die Module korrelierten negativ mit der Manipulation)19. Es wurde vorhergesagt, dass Wirts-GPCR-verwandte PPI-Proteine ​​16 Pilzproteine ​​binden, darunter fünf uSSPs, eine Carboxylesterase, eine Glycosylhydrolase, ein CAP-Cystein-reiches sekretorisches Protein und eine Protein-Tyrosinphosphatase. Die meisten dieser Pilzproteine ​​wurden zuvor dem Pilz-uSSPs und -Effektormodul F2 (n = 9) zugeordnet, einige waren jedoch in den Modulen F1–4 (Ergänzungsdatei S1) enthalten, die alle auch mit Infektion und Manipulation von Wirten korrelierten.

Anreicherungen für C. floridanus-Proteine ​​in PPIs mit hochregulierten sekretierten Pilzproteinen. GO-Begriffe werden im semantischen Raum dargestellt, der über keine inhärente Einheit oder Wert verfügt, mit Ausnahme der Möglichkeit, Begriffe nach funktionaler Ähnlichkeit zu gruppieren. Einige Beschriftungen wurden aus Gründen der Lesbarkeit und wenn sie für unsere Diskussion der Ergebnisse nicht relevant waren, weggelassen.

Die Anreicherungssignale für GPCRs blieben erhalten, nachdem wir sowohl PPIs als auch Wirtsproteine ​​entfernt hatten, die mit aspezifischen Pilzen geteilt wurden (Abb. 4). 28 der 33 GPCR-Wirtsproteine ​​blieben nach der Entfernung gemeinsamer PPIs übrig. Allerdings blieben nach dem Herausfiltern gemeinsamer Wirtsproteine ​​nur sieben übrig. Diese Wirtsproteine, von denen vorhergesagt wurde, dass sie während der Manipulation eindeutig von Ophiocordyceps gebunden werden, waren ein mutmaßlicher Dopaminrezeptor 2, ein Oamb-Octopaminrezeptor, ein Methusalem-ähnlicher 10-Rezeptor, ein Orexinrezeptor, ein Trissinrezeptor, eine cAMP-abhängige Proteinkinase-Untereinheit und ein Rezeptor ohne informativen BLAST Beschreibung („uncharakterisiertes Protein“). Die vier Ophiocordyceps-Proteine, die diese Wirtsrezeptoren binden, wurden in vielen PPIs vorhergesagt (Bereich = 101 bis 458). Der Dopaminrezeptor 2, der Oamb-Octopaminrezeptor und der nicht charakterisierte Rezeptor hatten denselben Pilz-uSSP-Partner. Die Orexin- und Trissin-Rezeptoren teilten auch ein nicht annotiertes sekretiertes Pilzprotein (größer als ein uSSP).

PPI-Netzwerk mit Wirtsproteinen, die zur Anreicherung ausgewählter GO-Terme beitragen. Wirtsproteine ​​(blaue quadratische Knoten) werden geclustert und nach ihrer allgemeinen GO-Begriffsfunktionskategorie gekennzeichnet und mit ihren Pilz-PPI-Partnern verbunden (graue Linienkanten), bei denen es sich entweder um sekretierte Proteine ​​(kleine rosa Kreisknoten) oder um uSSPs (große rote Dreiecksknoten) handelt Es wurde festgestellt, dass während der Manipulation des Camponotus-Verhaltens durch Ophiocordyceps eine Hochregulierung erfolgte. Proteine ​​können über PPI-Verbindungen verfügen, die über die hier dargestellten hinausgehen. (a) PPI-Netzwerk ohne aspezifische PPI-Filterung. (b) Netzwerk verbleibender PPIs nach Entfernung gemeinsamer PPIs mit aspezifischen Pilzen. Obwohl fast 30 % der PPIs (Kanten) entfernt wurden, blieben die meisten Proteine ​​(Knoten) und Anreicherungsergebnisse erhalten. (c) Netzwerk der verbleibenden PPIs nach der Entfernung der PPIs mit allen Wirtsproteinen, die auch mit aspezifischen Pilzen interagierten, unabhängig von der Orthologie des Pilzbindungspartners. GO-Begriffe im Zusammenhang mit der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung und einigen Oxidations-Reduktionsanreicherungen blieben nach diesem Filter bestehen. Anreicherungssignale für Transkription und DNA-Bindung gingen verloren, einige einzelne Proteine ​​blieben jedoch erhalten.

Wir fanden auch die Anreicherung von Oxidations-Reduktions-Funktionen unter Camponotus-Proteinen in PPIs (sechs unterstützende GO-Begriffe) (Abb. 3, Ergänzungsdatei S1). Insgesamt hatten 159 Wirtsproteine ​​Oxidations-Reduktions-Annotationen und bildeten 321 PPIs mit 48 Parasitenproteinen. Eine Vielzahl der Wirtsproteine ​​wurde durch Cytochrom-P450-Gene kodiert (70 einzigartige Gene, 15 mutmaßliche Subtypen). Diese Fülle an Cytochrom P450, einem Hämoprotein, trug auch zur Anreicherung der GO-Begriffe „Häm-bindend“ und „Eisenionen-bindend“ (Abb. 3) und der PFAM-Domäne „Cytochrom P450“ (Ergänzungsdatei S1) bei. Diese Camponotus-Cytochrom-P450-Proteine ​​gepaart mit 10 einzigartigen Ophiocordyceps-Genen, bestehend aus uSSPs und pilzlichen Cytochrom-P450-Genen. Weitere bemerkenswerte Mitwirkende an der Anreicherung von Funktionen im Zusammenhang mit der Oxidationsreduktion durch den Wirt waren Peroxiredoxine, Laccasen, Dehydrogenasen und ein vat-1-Protein der synaptischen Vesikelmembran (Ergänzungsdatei S1). Zu den 48 Pilzproteinen gehörten Cytochrom P450, Oxidasen und Oxidoreduktasen, Amidasen, Peptidasen und ein Enterotoxin.

Anreicherungssignale für vier der sechs Oxidations-Reduktions-GO-Terme blieben erhalten, nachdem wir PPIs entfernt hatten, die mit den aspezifischen Pilzen geteilt wurden. Nachdem wir den strengeren Shared-Host-Proteinfilter angewendet hatten, blieben nur noch zwei übrig (Ergänzungsdatei S2). Darüber hinaus wurden Indikatoren für Cytochrome, Häm- und Eisen-bindende GO-Begriffe und die PFAM-Domäne „Cytochrom P450“ nach jedem Filter weiterhin angereichert (Ergänzungsdatei S2). Die meisten Wirtsproteine ​​passierten den gemeinsamen PPI-Filter (140 von 159), aber nur 19 blieben nach der Entfernung der gemeinsamen Wirtsproteine ​​übrig (Abb. 4). Cytochrom P450-Proteine ​​​​verlagerten sich nach gemeinsamer Wirtsproteinfilterung (17 von 19 Proteinen) von einer Vielzahl zu einer dominanten Mehrheit mit acht Cytochrom P450-Subtypen: 3A19, 315a1, 4C1, 49a1, 6a13, 6a14, 6k1 und 9e2.

Es wurden mehrere Anreicherungen angereichert, die mit der Gentranskription und -regulation in Zusammenhang stehen können. Wir fanden 204 Wirtsproteine ​​mit Anmerkungen zu „DNA-Bindung“, „Aktivität des DNA-bindenden Transkriptionsfaktors“, „sequenzspezifische DNA-Bindung“, „DNA-Helikase-Aktivität“, „Regulation der Transkription, DNA-gesteuert“ und „mRNA“. verbindliche“ GO-Begriffe (Abb. 3). Diese Proteine ​​trugen in ähnlicher Weise zur hohen Anreicherung von PFAM-Domänen wie der „Helix-Loop-Helix-DNA-Bindungsdomäne“, dem „Zink-Finger-C4-Typ“, der „Paired-Box-Domäne“ und dem „bZIP-Transkriptionsfaktor“ bei (Supplementary File S1). ). Diese 204 Wirtsproteine ​​interagierten mit 43 Pilzproteinen und erzeugten 922 PPIs. Unter den 204 Wirtsproteinen fanden wir Transkriptionsfaktoren und Regulatoren mit vielen Funktionen, darunter Beispiele, die mit Insektenverhalten und neuronalen Funktionen in Zusammenhang stehen, wie z. B. neuromuskuläre Verbindungsfunktion), Hairy (z. B. Juvenilhormon-vermittelte Genrepression), Photorezeptor-spezifischer Kernrezeptor (Lichtwahrnehmung), CLOCK (zirkadiane Uhren) sowie Steroid- und Ecdyson-Kernrezeptoren und induzierte Proteine71,72,73,74,75 . Andere Proteine, die bisher aus der Perspektive der neuronalen Entwicklung am klarsten verstanden wurden, erzeugen bei Fehlregulierung atypische Verhaltens- oder Bewegungsphänotypen und umfassen Jim Lovell, Dead Ringer, Hairy/Enhancer-of-Split-bezogene Proteine, Achaete-Scute-Komplexproteine ​​und Forkhead76,77. 78,79,80,81. Diese 34 als biologisch relevante Beispiele betrachteten Proteine ​​machen 186 der 922 Genregulations-PPIs aus und interagieren mit 20 Ophiocordyceps-Proteinen, die eine ähnliche Bandbreite an Proteintypen abdecken wie die 43 Parasitenproteine ​​insgesamt (Ergänzungsdatei S1). Zu den 43 Pilzproteinen gehörten fünf uSSPs, die auch in den oben beschriebenen PPIs gefunden wurden (Abb. 4A), drei, die nicht gefunden wurden, sowie verschiedene Hydrolasen, Oxidoreduktasen, Peptidasen und Carboxylesterasen.

Alle oben genannten GO-Begriffe und PFAM-Domänen wurden nach der Entfernung gemeinsamer PPIs weiterhin angereichert (191 von 204 Wirtsproteinen blieben erhalten), aber keine dieser Annotationen wurde nach der Entfernung gemeinsamer aspezifischer Wirtsproteine ​​weiterhin angereichert (fünf Wirtsproteine ​​blieben erhalten) (Abb. 4, Ergänzungsdatei S2).

Wir fanden 28 Ameisenproteine, die den angereicherten GO-Begriff „Strukturbestandteil der Kutikula“ (Abb. 3) und die PFAM-Domäne „Insektenkutikulaprotein“ (Ergänzungsdatei S1) gemeinsam hatten. Wir haben vorhergesagt, dass diese Ameisenproteine ​​mit 22 Pilzproteinen interagieren und 138 PPIs bilden (Abb. 4A). Zu diesen Wirtsproteinen gehörten (Pro-)Resilin, Strukturproteine ​​der Endokutikel und eine Reihe von „Kutikulaproteinen“ (z. B. „Kutikulaprotein 7“). Zu den Pilzproteinen gehörten ein CAP-Protein und eine Carboxylesterase, von denen ebenfalls vorhergesagt wurde, dass sie GPCRs binden (siehe oben). Vier Pilz-uSSPs wurden mit den Transkriptions- und DNA-bindenden Wirtsproteinen geteilt. Wir identifizierten außerdem eine Glycosylhydrolase, eine Disintegrin/Reprolysin-ähnliche Peptidase, eine S8-Subtilisin-ähnliche Serinpeptidase, M43-Peptidasen, ein uSSP und ein nicht annotiertes sekretiertes Protein (größer als ein uSSP). Diese Anreicherungen wurden nur unter dem aspezifischen gemeinsamen PPI-Filter (mit allen 28 ursprünglichen kutikulären Proteinen) gehalten und gingen mit dem gemeinsamen Wirtsproteinfilter verloren (keines der 28 Proteine ​​wurde eindeutig von Ophiocordyceps gebunden) (Abb. 4, Ergänzungsdatei S2).

Camponotus-Gene, von denen zuvor festgestellt wurde, dass sie während der Manipulation unterschiedlich exprimiert werden, sowie Wirtsgenmodule, die mit der Manipulation korrelieren, wurden unter PPI-Proteinen angereichert (Supplementary File S1). Sowohl hoch- als auch herunterregulierte Wirts-DEGs wurden angereichert. Die hochregulierten Wirts-DEGs wurden für Gen-/DNA-Regulationsfunktionen und die herunterregulierten DEGs für Oxidations-Reduktion angereichert (Ergänzungsdatei S1). Es wurden drei Ameisen-WGCNA-Module angereichert, die signifikante Korrelationen zur Manipulation aufwiesen, und weitere sechs, bei denen dies nicht der Fall war (von insgesamt 22 möglichen Modulen). „Neuronale Prozesse“ Modul A14 korrelierte negativ mit Manipulation und Pilz-uSSP und Effektormodul F1 (Abb. 2). Dieses Wirtsmodul umfasste viele Gene, die vermutlich mit der neuronalen Funktion assoziiert sind, einschließlich der oben beschriebenen GPCRs19. Das andere neuronale Prozessmodul des Wirts, A15, war nicht mit PPIs angereichert. Modul A10 korrelierte positiv mit Manipulation und enthielt Anreicherungssignale für GO-Begriffe, die auf „Signaltransduktion und Transkription“ hinweisen19 (Abb. 2). Modul A4 hatte eine positive Korrelation zur Manipulation und enthielt Anreicherungssignale für „Proteasomen und Geruchserkennung“19 (Abb. 2). Alle drei dieser Hostmodule haben den Shared-PPI-Filter bestanden, blieben jedoch nach dem Entfernen gemeinsamer Hostziele mit aspezifischen Pilzen nicht bestehen.

Die interspezifischen molekularen Wechselwirkungen während der Manipulation von C. floridanus durch O. camponoti-floridani werden wahrscheinlich durch Parasiteneffektorproteine ​​vermittelt, die auf Wirtsproteine ​​abzielen. Um solche PPIs vorherzusagen, verwendeten wir das maschinelle Lerntool D-SCRIPT, das strukturelle Beziehungen zwischen Proteinen ableitet, ohne sich auf proteinweite Sequenzhomologie zu bekannten Wechselwirkungen zu verlassen. Diese Flexibilität ermöglicht es D-SCRIPT-Modellen, Vorhersagen auf Organismen und über zuvor dokumentierte PPIs hinaus auszuweiten. Wir haben D-SCRIPT mit einem Datensatz verglichen, der experimentell unterstützte Pilz-Tier-PPIs enthielt. Diese Bewertung ergab, dass D-SCRIPT aussagekräftige Vorhersagen zu interspezifischen PPIs liefern kann, obwohl es bei Daten zu einzelnen Arten eine bessere Leistung erbringt. D-SCRIPT sagte mehrere tausend PPIs zwischen Camponotus-Wirtsproteinen und hochregulierten, sekretierten Ophiocordyceps-Parasitenproteinen voraus. Selbst bei geringem Recall (Identifizierung echter PPIs) können funktionelle Anreicherungen und Trends auf Gruppenebene plausibel erkannt werden. Korrekte PPI-Vorhersagen spiegeln ein echtes biologisches Signal wider, während Rauschen bei falscher Vorhersage höchstwahrscheinlich nicht häufig zu kohärenten Anreicherungssignalen führen würde.

Aufgrund des ungewohnten Terrains für die Nutzung dieses Ansatzes zwischen Nicht-Modellarten versuchten wir, Hypothesen vorzuschlagen, die biologische Plausibilität und die Möglichkeit neuartiger Wechselwirkungen in Einklang bringen. Einerseits betrachteten wir PPI-Vorhersagen im Lichte früherer Kenntnisse über Protein- und Zellfunktionen. Da die molekularen Aspekte der parasitären Manipulation jedoch noch weitgehend ungeklärt sind, haben wir auch angenommen, dass diesen Wechselwirkungen unbeschriebene oder ungewöhnliche Mechanismen zugrunde liegen könnten. Wir fanden oft heraus, dass einzelne Proteine, insbesondere aus Ophiocordyceps, in mehreren Wirt-Parasit-PPIs vorkamen. Obwohl es sich in manchen Fällen um fehlerhafte Vorhersagen handeln könnte, könnten Ophiocordyceps-Effektoren tatsächlich viele Wirtsproteine ​​über verschiedene Wege binden. Dies ist ein häufig beobachtetes Phänomen bei Mikroben-Pflanzen-Interaktionen und möglicherweise sogar die Norm2,4. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass nur der S8-Peptidase-Annotation-Term unter den von Ophiocordyceps sezernierten, hochregulierten Proteinen angereichert war, die in PPIs mit Camponotus-Proteinen enthalten waren. Dieser Befund weist darauf hin, dass es sich bei den PPI-Proteinen nicht um eine deutlich vom Pilzsekretom (d. h. Hintergrundproteine ​​der Anreicherungsanalyse) getrennte Untergruppe handelt, die hinsichtlich der Pathogenese und proteolytischen Aktivität insgesamt funktionell angereichert ist19. Im Gegensatz dazu haben wir viele angereicherte Anmerkungen für die Host-Seite der Interaktionen entdeckt.

Pilz-PPI-Proteine ​​waren mit S8-Peptidasedomänen angereichert, was darauf hindeutet, dass eine erhebliche Anzahl dieser Proteine ​​proteolytische Funktionen mit möglicherweise unterschiedlichen Zielen hatte82. Kutikuläre Wirtsproteine ​​sind ein kanonisches Ziel für solche Effektoren, wie wir weiter unten diskutieren. Darüber hinaus befanden sich mehrere Kinesin-Motorproteine ​​des Wirts in PPIs mit diesen Ophiocordyceps-Proteasen. Kinesine spielen eine Rolle bei mitotischen und intrazellulären Transportprozessen – mit Schlüsselfunktionen beim Vesikeltransport zur Peripherie von Neuronen83. Defekte in der Kinesin-Aktivität können zu einer gestörten Freisetzung von Neurotransmittern an Synapsen führen und so zu einer Beeinträchtigung der neurologischen Funktionen und Entwicklung beitragen83,84. Aus diesen vorhergesagten S8-Peptidase-Kinesin-Wechselwirkungen schließen wir, dass der Pilz möglicherweise die Kernprozesse der Wirtszelle fehlreguliert. Die Auswirkungen beeinträchtigen möglicherweise die neuronale Signalübertragung und die Freisetzung von Neurotransmittern und tragen so zu veränderten Verhaltensphänotypen bei. Wir haben auch vorhergesagt, dass diese Peptidasen mit mehreren Kernporenproteinen von Camponotus interagieren. Obwohl einige Komponenten der Kernpore einer proteolytischen posttranslationalen Modifikation unterzogen werden, um die SUMOylierung aufzuheben85,86, gehören diese Peptidasen zu einer anderen Familie als die S8-Peptidasen. Wenn die vorhergesagten Wechselwirkungen zwischen S8-Peptidase und Nukleoporenproteinen echt sind, könnte dies bedeuten, dass der Parasit den Transport von Molekülen in und aus dem Wirtskern verändert. Vermutlich könnte dies den Eintritt der Pilzproteine ​​erleichtern, die die Transkriptionsfaktoren des Wirts binden.

Wir haben über 30 Ameisen-GPCRs oder GPCR-Untereinheiten in PPIs mit Pilzproteinen nachgewiesen. Die meisten GPCRs stammten aus der Rhodopsin/A-Familie und umfassten Rezeptoren, die mit biogenen Monoaminen, Acetylcholin und Neuropeptiden in Zusammenhang stehen. Diese Rezeptoren bieten eine Vielzahl hypothetischer Verbindungen zu manipuliertem Ameisenverhalten. Im Allgemeinen werden diese Rezeptoren und ihre Liganden mit Fortbewegung, Nahrungsaufnahme und zirkadianen Rhythmen in Verbindung gebracht – Prozesse, die zuvor in Hypothesen über Ophiocordyceps und andere Verhaltensmanipulationen durch Pilz-Insekten-Gipfelkrankheiten hervorgehoben wurden10,14,19,87,88.

Die Monoamin-Neurotransmitter Dopamin, Serotonin, Octopamin (analog zu Noradrenalin von Wirbeltieren) und Tyramin sind an der Modulation des Bewegungs-, Futtersuch-, Lern-, Sozial-, Fortpflanzungs- und Aggressionsverhaltens bei vielen Insekten beteiligt, wobei experimentelle Beweise bei sozialen Insekten, einschließlich Ameisen, vorliegen89,90 ,91,92,93,94. Im Vergleich zu den getesteten aspezifischen Pilzen wurden sowohl ein Dopamin- als auch ein Octopaminrezeptor von C. floridanus in einzigartiger Weise durch hochregulierte sekretierte Proteine ​​von Ophiocordyceps gebunden. Diese Interaktion führt hypothetisch dazu, dass diese Wirtsrezeptoren an spezifischen Ophiocordyceps-Interaktionen beteiligt sind, beispielsweise an Verhaltensmanipulationen. Wir haben außerdem zwei muskarinische Acetylcholinrezeptoren entdeckt, die mit sensorischen und motorischen Neuronen bei Nicht-Insekten-Tieren assoziiert sind95,96,97. Bei Bienen kann eine übermäßige Aktivierung von Acetylcholinrezeptoren zu Veränderungen im Bewegungs-, Navigations-, Nahrungssuche- und Sozialverhalten führen98. Veränderungen in diesem Verhalten wurden auch bei C. floridanus-Ameisen beobachtet, die mit O. camponoti-floridani infiziert waren. Bei diesen Ameisen ist das Bewegungsverhalten verbessert, während das Sozialverhalten vermindert ist, tägliche Futtersuchaktivitäten arrhythmisch werden und die Navigationsfähigkeiten weniger effektiv erscheinen17.

Die Neuropeptid-GPCRs in PPIs verfügten über eine Reihe mutmaßlicher Liganden, die die Störung des Parasiten mit verhaltensregulierenden Prozessen wie dem Tagesrhythmus, der Signalübertragung von Nährstoffen, Insektenhormonen und der Geruchsaufnahme verknüpften. Zu diesen GPCRs gehörten ein Wirts-Trissin-Rezeptor und ein Allatotropin-Rezeptor (als „Orexin“-Rezeptor bezeichnet, bei Insekten jedoch wahrscheinlich ein Allatotropin-Rezeptor), an die im Vergleich zu den aspezifischen Pilzen nur Ophiocordyceps binden sollte. Mögliche Auswirkungen zwischen diesen beiden Rezeptoren sind eine Fehlregulation der Nahrungsaufnahme und die zirkadiane Kontrolle der Bewegungsaktivität, der Juvenilhormonproduktion, der Immunaktivierung und der Muskelstimulation99,100,101,102,103,104,105. Der zirkadiane Rhythmus hängt mit dem Futtersuchverhalten der Ameisen (und möglicherweise indirekt mit der Nahrungsaufnahme) zusammen und wird durch eine Ophiocordyceps-Infektion beeinflusst17. Das synchronisierte Gipfel- und Beißverhalten zur Tageszeit deutet außerdem auf eine Rolle bei der zirkadianen Kontrolle der Aktivität hin15,19,23. Juvenilhormon ist mit den Nahrungs- und Nahrungssucheprozessen bei Ameisen verknüpft und vermittelt Insulin/Fütterungssignale und die soziale Kastenidentität (z. B. Nahrungssuchende)28,106,107,108. Unter den Wirts-Neuropeptid-GPCR-Zielen, die mit den aspezifischen Pilzen geteilt werden, haben wir die Bindung von Rezeptoren vorhergesagt, die auch mit Fortbewegungs- und Aktivitätsniveaus, Nahrungsaufnahme, Aggression, Muskelkontrolle, Juvenilhormon, Fortpflanzungsverhalten oder Pheromonen verbunden sind, einschließlich derjenigen, die aktiviert werden durch: Allatostatin-A109, 110,111,112, adipokinetisches Hormon oder Corazonin (d. h. ein „Gondaotropin-Releasing-Hormon“-Rezeptor)113, Cholecystokinin-ähnliche Peptide114, CCHamid-2115 und Pyrokinin, Pheromonbiosynthese aktivierendes Neuropeptid (PBAN) und/oder Neuropeptide vom Capa-Typ116,117,118. Geruchs- und Pheromonerkennung sind Schlüsselelemente der Ameisenkommunikation, Verhaltensregulierung und sozialen Interaktionen119,120,121. GPCRs, die typischerweise an der Reaktion auf Geruchsstoffe beteiligt sind, können durch Pilzeffektoren fehlreguliert werden, um die Interaktion mit Nestkameraden zu dämpfen und/oder abweichendes Verhalten ohne normale Signale hervorzurufen. Insgesamt fanden wir mehrere PPIs, an denen Ameisen-GPCRs beteiligt sind, die vermutlich an Signalsystemen beteiligt sind, die steuern könnten, welche Verhaltensweisen manipulierte Ameisen wann ausführen.

Wir haben auch PPIs vorhergesagt, an denen eine mutmaßliche cAMP-abhängige katalytische Proteinkinase-Untereinheit des Wirts beteiligt ist, die nur zwischen Ophiocordyceps und Camponotus vorkommt, und eine G-Protein-Untereinheit Alpha des Wirts, die beide eine wichtige Rolle als Komponenten von GPCRs spielen. Auch bei manipuliertem Camponotus19 wurde zuvor festgestellt, dass diese Alpha-Untereinheit herunterreguliert ist. Bisher wurde angenommen, dass die Störung der GPCR-Signalübertragung durch Ophiocordyceps zumindest teilweise durch Enterotoxine und andere Pilzproteintoxine vermittelt wird, die die cAMP-Spiegel und die Signaltransduktion beeinträchtigen14,19,24,25.

Angesichts des Signals für GPCR-Interferenzen sowohl bei unserer umfassendsten als auch bei unserer engsten Analyse und der Tatsache, dass sich viele dieser Rezeptoren/Liganden in ihren Verhaltensassoziationen überschneiden, schlagen wir vor, dass dies Hinweise auf Wirt-Parasit-GPCR-PPIs als einen von Ophiocordyceps verwendeten Mechanismus zur Verhaltensmanipulation liefert . Die Pilzgegenstücke in diesen Wirts-GPCR-Parasit-Effektor-PPIs wurden häufig in vielen Wechselwirkungen vorhergesagt. Zu diesen Pilzproteinen gehörten fünf uSSPs, die während der Manipulation hochreguliert wurden und mit der Manipulation in WGCNA-Modulen korrelierten19. Da diese Pilzproteine ​​keine Annotationen haben, können wir noch nicht bestimmen, ob es sich um Agonisten oder Antagonisten handelt, noch ob sie an die Ligandenstelle oder an eine andere Stelle des Rezeptors binden. Da nicht vorhergesagt wurde, dass diese uSSPs nur diese Wirtsproteine ​​binden, wird ihre Interaktion mit den Rezeptoren möglicherweise weniger wahrscheinlich durch spezifische Rezeptor-Ligand-Bindungsstellen vermittelt als durch generischere Kontaktstellen an anderer Stelle des Wirtsproteins.

Wir haben über 300 PPIs vorhergesagt, die zu einer Anreicherung der Oxidations-Reduktions-Prozesse zwischen den Wirtsproteinen beitragen. Oxidations-Reduktions-Prozesse können an einer Reihe von Stoffwechsel-, Entwicklungs- und Wirt-Parasit-Interaktionswegen beteiligt sein, von denen zuvor angenommen wurde, dass sie bei Ophiocordyceps-Infektionen eine Rolle spielen14,19,122,123. Ungefähr die Hälfte der Wirtsproteine ​​waren mutmaßliche Cytochrom-P450-Proteine, wobei die Anreicherungssignale für Cytochrom-P450-Proteine ​​nach aspezifischer Pilzfilterung erhalten blieben. Bei Insekten sind Cytochrom-P450-Proteine ​​häufig am Hormonstoffwechsel (z. B. Ecdyson und Juvenilhormon), der Stressreaktion, xenobiotischen Entgiftungsprozessen und der kutikulären Entwicklung beteiligt124,125,126,127,128,129,130. Beispielsweise fanden wir mehrere Cytochrom-p450-Proteine, die eindeutig von Ophiocordyceps des 4C1-Subtyps gebunden werden, der an Stressreaktionen (z. B. soziale Isolation, Temperatur, UV-Strahlung oder Hunger) und der Insektizid-/Xenobiotika-Entgiftung beteiligt ist und durch Hormone, einschließlich juveniler Hormone, reguliert wird Hormon126,131,132,133,134. D-SCRIPT wiederum sagte voraus, dass viele dieser Wirts-Cytochrom-P450-Zellen mit Pilz-Cytochrom-P450-Zellen interagierten. Obwohl Cytochrom-P450-Proteine ​​oft unabhängig voneinander agieren, kann die Homo- und Heterodimerbildung von Cytochrom-P450-Proteinen die Proteinfunktion auf positive, negative und substratspezifische Weise modulieren135. Oxidations-Reduktions-bezogene PPIs könnten am stärksten den physiologischen Stress und die antagonistischen zellulären Prozesse zwischen Wirt und Parasit darstellen. Allerdings kann die Störung dieser Signalwege durch Pilze auch ein entscheidender Faktor bei der Schaffung eines Wirts sein, der anfällig für Manipulationen ist.

Wir fanden Anzeichen dafür, dass Ophiocordyceps die Genregulation von Camponotus über Proteine, die Wirtstranskriptionsfaktoren und DNA- oder mRNA-bindende Proteine ​​binden, stören könnte. Die Nutzung der eigenen Zellen des Wirts zur Fehlregulierung von Verhaltensweisen könnte für den Parasiten metabolisch günstig sein. Einige der Pilzproteine ​​in diesen PPIs waren uSSPs und wir können daher das funktionelle Ergebnis dieser PPIs nicht vorhersagen. Allerdings handelte es sich bei mehreren Parasitenproteinen um Hydrolasen. Wir schlagen vor, dass diese Hydrolasen Wirtsproteine ​​oder deren posttranslationale Modifikationen am plausibelsten spalten. Abhängig von der Rolle des Proteins und der spezifischen gebrochenen Bindung kann die Hydrolaseaktivität des Parasiten die Transkription von Wirtsgenen erhöhen oder verringern. Unter den ca. Unter 200 Wirtsproteinen in der Kategorie der Nukleotidbindungen fanden wir viele, die über Veränderungen in der Fortbewegung, der Nahrungsaufnahme/Nahrungssuche, der Gravitaxis, der Lichtwahrnehmung, den zirkadianen Uhren, der Entwicklung und der sozialen Kastenzugehörigkeit sowie der neuronalen Aufrechterhaltung an Verhaltensaktivitäten gebunden sind. Transkriptionsinterferenzen decken eine ähnliche Bandbreite an Prozessen ab wie die Wirts-GPCRs in PPIs und könnten eine ergänzende Strategie von Parasiten sein, um ihre Wirte zu modifizieren. Allerdings bestanden nur sehr wenige dieser mutmaßlichen Ziele den strengsten gemeinsamen aspezifischen Wirtsproteinfilter. Daher sind spezifische Hypothesen über einzelne Transkriptionsfaktoren schwer zu analysieren. Als breitere funktionelle Kategorie überschneiden sich viele dieser Wirtsproteine ​​jedoch mit Prozessen, die für manipuliertes Ameisenverhalten relevant erscheinen.

Während der Manipulation sezerniert der Pilz auch Proteine, von denen man annimmt, dass sie die Cuticula- und Bindegewebsproteine ​​des Wirts binden. Als Endoparasit hat Ophiocordyceps direkten Zugang zum inneren Bindegewebe des Wirts, zur Endokutikelschicht (sobald die Epidermis durchbrochen ist) und zur Kutikulaauskleidung von Darm und Luftröhre, zu der auch Gewebe gehören, die Chitin enthalten70,136. Allerdings enthält die Zellwand des Pilzes auch Chitin. Daher können wir nicht vollständig ausschließen, dass es sich bei einigen dieser sekretierten Pilzproteine ​​einfach um zellwandmodifizierende Proteine ​​handeln könnte, von denen fälschlicherweise vorhergesagt wurde, dass sie Chitin-assoziierte Ameisenproteine ​​binden. Dennoch könnte der Pilz kutikuläre Proteine ​​abbauen, um sich zu ernähren, Muskeln abzulösen oder das Entstehen von Hyphen vorzubereiten, die später aus dem Kadaver des Wirts wachsen. Bestätigende Beweise für die Störung der Muskulatur stammen aus detaillierten mikroskopischen Arbeiten an Ophiocordyceps-infizierten Ameisen zum Zeitpunkt des manipulierten Gipfel- und Beißverhaltens. Diese Berichte beschreiben visuelle Anzeichen einer Pilzinvasion, eines Gewebeabbaus und einer Atrophie der manipulierten Unterkiefermuskeln der Ameise15,22,29,137.

Zu den vorhergesagten Pilzinteraktionen mit Wirtsstrukturproteinen gehörten mehrere Proteasen wie eine M43-ähnliche Metalloprotease und eine S8-Subtilisin-ähnliche Serinpeptidase. S8-Peptidasen können die Kutikula von Insekten abbauen und kommen in vielen Pilzen vor138,139. Wir haben auch nicht annotierte sekretierte Proteine ​​in kutikulären Protein-PPIs entdeckt, die ähnliche oder unterschiedliche Funktionen haben könnten. Zu den aspezifischen Pilzen gehörte ein generalistischer Entomopathogen, der eine Vielzahl von Insektengewebe abbauen kann (C. bassiana); In Übereinstimmung damit fanden wir keine Ophiocordyceps-spezifischen kutikulären Protein-Wirtsziele.

Ophiocordyceps-PPI-Proteine ​​wurden für WGCNA-Module angereichert, die transkriptionell mit Manipulation assoziiert sind und uSSPs und andere zuvor vermutete Effektoren (F1 und F2) enthalten19. Bei Camponotus unterstützen Genmodule, die mit neuronalen Prozessen und GPCRs (A14) sowie Signalübertragung und Transkription (A10) verbunden sind, die Beteiligung dieser Prozesse an Manipulationen19. Unter der Annahme einer „Schuld-durch-Assoziation“ könnte dies in einigen Fällen darauf hinweisen, dass diese PPIs mit Infektions- und Manipulationsprozessen zusammenhängen, auch wenn uns noch klare mechanistische Hypothesen darüber fehlen (z. B. PPIs mit uSSPs)140,141,142. Darüber hinaus waren sowohl hochregulierte als auch herunterregulierte Wirts-DEGs19 mit vorhergesagten PPIs angereichert, was möglicherweise auf homöostatische Reaktionen auf die Modulation funktioneller Proteinspiegel durch Pilze hinweist. Daher stimmen die Vorhersagen auf Proteomebene, die wir in dieser Studie gemacht haben, gut mit früheren Arbeiten zur Transkriptomik überein. Daher dient diese Arbeit als zusätzliche Beweislinie für bestimmte Wirtsprozesse und schränkt den Pool gut unterstützter Effektorkandidaten ein, die an Verhaltensmanipulationen beteiligt sind.

Angesichts der Herausforderung herauszufinden, wie ein Parasitismus mit zwei Nicht-Modellarten auf molekularer Ebene funktionieren könnte, haben wir mehrere Datentypen und Tools kombiniert, um Wirt-Parasit-PPIs vorherzusagen. Diese Ansätze sind in vielen Studiensystemen machbar, auch für diejenigen, denen möglicherweise die Werkzeuge für anspruchsvolle Funktionstests fehlen. Wir haben ein strukturbewusstes maschinelles Lernprogramm, D-SCRIPT, eingesetzt, um PPIs über gut dokumentierte Interaktionen hinaus vorherzusagen. Durch die Kombination genomischer und transkriptomischer Daten haben wir mit mehreren bioinformatischen Werkzeugen interessante PPIs ausgewählt, um (i) sekretierte Pilzproteine ​​zu annotieren, (ii) über verschiedene Arten vorhergesagte Interaktionen zu filtern und (iii) Proteine ​​auszuwählen, die mit einer erhöhten Genexpression während einer Infektion verbunden sind. Anhand der resultierenden PPIs führten wir Anreicherungsanalysen durch, um Funktionskategorien zu identifizieren, die robust gegenüber Rechenfehlerraten auf der Ebene der einzelnen PPI sein sollten. Zusammenfassend haben wir mehrere Hypothesen aufgestellt, die interspezifische PPI zwischen Wirt und Parasit mit Prozessen im Zusammenhang mit der Infektion und Manipulation von Camponotus durch Ophiocordyceps in Verbindung bringen. Wir haben Hinweise auf PPIs hervorgehoben, an denen pilzliche S8-Proteasen beteiligt sind, und auf PPIs, die Oxidations-Reduktions-Prozesse des Wirts, kutikuläre Proteine, Genregulation und GPCRs betreffen. Insbesondere mit analytisch belastbaren Ergebnissen und direkten biologischen Zusammenhängen mit dem Verhalten betonen wir die parasitäre Dysregulation der GPCR-Signalübertragung als Mechanismus der parasitären Verhaltensmanipulation.

Die für diese Studie verwendeten Genomassemblierungen sind auf NCBI verfügbar: O. camponoti-floridani (GCA_012980515.1), C. floridanus (GCA_003227725.1), C. bassiana (GCA_000280675.1), T. reesei (GCA_000167675.2), und S. cerevisiae (GCF_000146045.2)7,19,49,66,67. Transkriptomische Sequenzdaten für O. camponoti-floridani und C. floridanus werden auch auf NCBI (BioProject PRJNA600972) gehostet19. Die hier verwendeten analysierten transkriptomischen Daten sind auf figshare als ergänzende Informationen zu ihrer Originalveröffentlichung verfügbar (https://doi.org/10.25387/g3.12121659)19. Vorhersage- und Anreicherungsergebnisse sind in den mit diesem Artikel veröffentlichten Zusatzdateien S1 und S2 verfügbar.

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Wir möchten Bipabendu Das danken, der an den Diskussionen über Projektziele und -ansätze beteiligt war, und Anna Savage, die konstruktive Kommentare zu einem Entwurf dieses Manuskripts abgegeben hat.

Fachbereich Biologie, University of Central Florida, 4110 Libra Drive, Orlando, FL, 32816, USA

Ian Will, William C. Beckerson und Charissa de Bekker

Abteilung für Biologie, Mikrobiologie, Universität Utrecht, Padualaan 8, 3584 CH, Utrecht, Niederlande

Charissa de Bekker

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IW, WCB und C.dB. konzipierte das Projekt und schrieb das Manuskript. WCB führte die Sekretom-Annotation durch. IW führte PPI-Vorhersagen, Anreicherungsanalysen und Visualisierung durch. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (CAREER IOS-1941546 bis C.dB) unterstützt.

Korrespondenz mit Ian Will oder Charissa de Bekker.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 06. Januar 2023

Angenommen: 16. August 2023

Veröffentlicht: 24. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40764-8

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