Minimale mechanistische Komponente von HbYX

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 725 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Auswirkungen einer verminderten Proteasomfunktion auf neurodegenerative Erkrankungen in Kombination mit Studien, die die schützenden Wirkungen einer zunehmenden Proteasomaktivität in Tiermodellen zeigen, verdeutlichen die Notwendigkeit, die Fähigkeit zur Proteasomaktivierung durch kleine Moleküle zu verstehen. Das C-terminale HbYX-Motiv ist auf vielen Proteasom-bindenden Proteinen vorhanden und dient dazu, Aktivatoren an das 20S-Kernpartikel zu binden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Peptide mit einem HbYX-Motiv die 20S-Gate-Öffnung autonom aktivieren können, um den Proteinabbau zu ermöglichen. In dieser Studie entwerfen wir durch einen iterativen Prozess der Peptidsynthese ein HbYX-ähnliches Dipeptid-Mimetikum, das nur die grundlegenden Komponenten des HbYX-Motivs darstellt. Das Mimetikum induziert stark die Toröffnung in Proteasomen von Archaeen, Hefen und Säugetieren. Wir identifizieren mehrere Reste der Proteasom-α-Untereinheit im archaealen Proteasom, die an der HbYX-abhängigen Aktivierung beteiligt sind. Wenn es durch das Mimetikum stimuliert wird, kann das 20S von Säugetieren ungefaltete Proteine wie Tau abbauen. Erkenntnisse unter Verwendung unseres Peptid-Mimetikums legen nahe, dass der HbYX-abhängige Mechanismus eine kooperative Bindung in mindestens zwei Taschen zwischen den Untereinheiten des α-Rings erfordert. Am wichtigsten ist, dass unser Peptid-Mimetikum die Proteasom-Beeinträchtigung durch Oligomere im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen umkehrt. Zusammenfassend bestätigen diese Ergebnisse, dass HbYX-ähnliche Moleküle ein starkes Potenzial zur Stimulierung der Proteasomfunktion haben und möglicherweise für die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen nützlich sind.

Das Proteasom ist eine Schlüsselkomponente des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS), das für die Entfernung beschädigter oder nicht benötigter Proteine und die Regulierung wichtiger zellulärer Prozesse verantwortlich ist1. Die Regulierung durch Proteasomaktivatoren (PAs) ist entscheidend, um sicherzustellen, dass nur die richtigen Proteine abgebaut werden. Eine Fehlregulation des Proteasoms ist mit mehreren neurodegenerativen Erkrankungen (NDs) verbunden, die häufig durch eine Beeinträchtigung der Proteasomfunktion gekennzeichnet sind2,3,4,5,6,7. Der Zweck dieser Studie besteht darin, die minimalen Proteasom-aktivierenden Elemente von HbYX-abhängigen Proteasom-Aktivatoren zu definieren und einen molekularen Rahmen bereitzustellen, um Ansätze zur Arzneimittelentwicklung zu leiten, die auf die Aktivierung des proteasomalen Abbaus zur Behandlung von ND abzielen, was folglich dazu beitragen soll, die Entstehung von ND aufzuklären -assoziierte Oligomere beeinträchtigen die Proteasomfunktion. Das Kernpartikel des eukaryotischen Proteasoms, auch als 20S bezeichnet (Abb. 1a), besteht aus vier gestapelten heteroheptameren Ringen (α-β-β-α) mit einer zentralen Pore für den Substrateintritt. Die β-Ringe bestehen aus sieben Untereinheiten (β1-7), von denen drei Proteasestellen enthalten. Die beiden α-Ringe bestehen ebenfalls aus sieben Untereinheiten (α1-7). Der Substrateintritt in die 20S wird durch das Tor reguliert, das hauptsächlich aus dem N-Terminus von α 2, 3 und 4 besteht, der sich über die zentrale Pore erstreckt und so diese fassförmige Struktur verschließt8. Die geschlossene Gate-Konformation blockiert die zentrale Pore und verhindert, dass Proteine in die 20S gelangen und dort abgebaut werden. Der N-Terminus jeder α-Untereinheit trägt ein YDR-Motiv (Tyrosin-Aspartat-Arginin), das mit benachbarten N-Termini interagiert, um den geschlossenen Zustand des Gates zu stabilisieren8. Diese N-Termini-Erweiterungen können auch ihre Konformation in einen „offenen“ Zustand ändern, wobei sie von der α-Ringpore nach oben und nach außen zeigen, was durch eine alternative Wechselwirkung vom YDR-Motiv 9 stabilisiert wird. Zusätzlich kommt es zu einer Verkürzung des N-Terminus von α3 (α3∆N), die als zentraler Dreh- und Angelpunkt zur Stabilisierung des geschlossenen Zustands fungieren, erzeugen ein konstitutiv offenes (aktives) 20S, das in hohem Maße in der Lage ist, unstrukturierte Proteine abzubauen8,10. Durch NMR-Analyse wurde vermutet, dass die Grundkinetik der archaischen 20S-Toröffnung Schwankungen beim Öffnen/Schließen auf einer Zeitskala von Sekunden unterliegt11,12. Obwohl die Kinetik für das Säugetier-20S (M20S) noch nicht gemessen wurde, lässt das Vorhandensein basaler Protein- oder Peptidhydrolyseaktivitäten darauf schließen, dass das M20S-Gate ebenfalls zwischen diesen Zuständen schwankt, wenn auch wahrscheinlich langsamer.

a Oberflächendarstellung von 20S-Proteasomen im Komplex mit Aktivatoren [Human 26S (PDB 6msk), Hefe 20S+Blm10 (PDB 4v7o), archaeales 20S + PAN (PDB 6hed)]. Sichtbare HbYX-Motive sind rot-orange gefärbt und benachbarte α-Untereinheiten des sichtbaren HbYX-Motivs sind in verschiedenen Farben dargestellt. b Oberflächendarstellung der 20S-α-Ringe (von a) entlang der Mittelachse mit entfernten Aktivatorkappen. Die C-Termini-HbYX-Reste des Proteasomaktivators sind rot-orange (Oberfläche) dargestellt. c Überlagerung der H20S- und Y20S-Interuntereinheitstaschen α5/6 und der T20S-Interuntereinheitstaschen α/α (Cartoon) von B mit HbYX-Motivresten (Stäbchen). Die Kristallstruktur des PAN-C-Terminus (PDB 3ipm) wird anstelle von Cryo-EM PDB 6hed gezeigt. Bilder wurden mit PyMOL gerendert. d Mehrfachsequenz-Alignment der T20S-α-Untereinheit mit verschiedenen eukaryotischen α6-Untereinheiten, erzeugt mit CLUSTAL OMEGA (1.2.4). e Konservierte Reste, die mit gebundenem HbYX-Motiv (Sticks) in der T20S-Intersubunit-Tasche (PDB 3ipm) interagieren. PAN-HbYX-Motiv (LYR), dargestellt in Cyan (Stab). f Rate des Substratabbaus (fluorogenes Nonapeptid-LFP) durch das Wildtyp-T20S-Proteasom (0,14 nM) oder K66/K33/L81-Mutanten, inkubiert mit oder ohne PAN (mit ATPγS). Die Stimulierung der Gate-Öffnung wurde anhand des Anstiegs der LFP-Hydrolyse (rfu/min) im Vergleich zu WT 20S ohne PAN gemessen. g Experimente mit T20S-Proteasom (0,35 nM Wildtyp- oder L81Y-Mutante) wurden wie in (f) durchgeführt. h Wie (E), wobei L81 zu Tyrosin mutiert ist (magentafarbener Stift). Bilder in e und h wurden mit PyMOL gerendert. Die Daten (Mittelwerte) sind repräsentativ für drei oder mehr unabhängige Experimente, die jeweils in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Fehlerbalken stellen ± Standardabweichung dar.

Während das 20S-Tor typischerweise den geschlossenen Zustand bevorzugt, kann die Bindung von Proteasom-Regulationskomplexen (Abb. 1a) an den α-Ring Konformationsänderungen auslösen, die eine Toröffnung verursachen, wodurch das 20S-Tor ungefaltete und linearisierte Substrate akzeptieren kann13,14. Es wurden zwei verschiedene Mechanismen der 20S-Toröffnung beschrieben, der HbYX-abhängige und der von der 11S-Familie abhängige Mechanismus. Bisher konzentrieren sich die meisten Studien zum HbYX-abhängigen Mechanismus auf das 19S, auch bekannt als PA700 oder Regulatory Particle (RP), das sich mit dem 20S verbindet, um den 26S-Komplex zu bilden, der ubiquitinierte Proteine abbaut (Abb. 1a). Das 19S besteht aus einem Basis-Subkomplex, der hauptsächlich aus einem heterohexameren Ring von ATPasen (Rpt1-6) besteht, und einem Deckel-Subkomplex, der Ubiquitin-bindende und -prozessierende Untereinheiten enthält. Es wurde gezeigt, dass 19S die Gate-Öffnung durch Andocken der C-terminalen Schwänze von Rpt1-6, von denen einige das HbYX-Motiv enthalten, in den Taschen zwischen den Untereinheiten des 20S-α-Rings stimuliert15. Die Verwendung von C-terminalen Schwänzen zur Assoziation mit dem 20S wurde auch bei anderen Proteasom-Aktivatoren (PAs) beobachtet, darunter PAN (Proteasom-aktivierende Nukleotidase; das archaische Homolog des 19S), PA200/Blm10 (Abb. 1a–c), und 11S-Aktivatoren.

Nicht alle C-terminalen Enden von PAs induzieren die Gate-Öffnung, wenn sie an das 20S gebunden sind, wie aus der Beobachtung hervorgeht, dass Peptide, die dem C-Terminus von PA26 (einem Mitglied der 11S-Familie) entsprechen, die Gate-Öffnung nicht autonom induzieren können16. Umgekehrt können Peptide, die dem C-Terminus von Rpt2, Rpt3, Rpt5, PAN und PA200/Blm10 entsprechen, autonom die Toröffnung induzieren16,17. Alle Peptide, die die Gate-Öffnung induzieren, tragen das HbYX-Motiv, das sich als wesentlich für die Assoziation dieser Komplexe mit dem 20S15,16 erwiesen hat. Das C-terminale HbYX-Motiv bindet in Taschen, die durch die Schnittstelle der α-Untereinheiten im 20S gebildet werden und als Intersubunit-Taschen bezeichnet werden (Abb. 1b, c). Während die C-Termini der PAN-homohexameren ATPasen alle ein HbYX-Motiv haben, haben nur die C-Termini von Rpt2, 3 und 5 der 19S-heteromeren ATPasen das HbYX-Motiv und Rpt1 hat ein partielles HbYX-Motiv, dem der Hb-Rest fehlt. Die Rolle, die die C-Termini von Rpt4 und Rpt6 (denen das HbYX-Motiv fehlt) bei der Assoziation der 19S-20S- und 20S-Gating-Regulierung spielen, sind unklar, es wurde jedoch beobachtet, dass sie über Vernetzung und Kryo-EM an Taschen zwischen Untereinheiten gebunden sind18,19, 20. Die Bindung von HbYX-Peptiden an Taschen zwischen Untereinheiten, die strukturell von den Gate-Resten entfernt sind, führt zu einer Änderung der Gate-Konformation. Dies zeigt, dass das HbYX-Motiv allosterisch funktioniert und wahrscheinlich erhebliche Konformationsänderungen in den α-Untereinheiten induziert, die wiederum die Konformation der Gating-Reste beeinflussen16,21.

Im Gegensatz dazu trägt die Familie der 11S-Aktivatoren kein HbYX-Motiv an ihren C-terminalen Enden. Ihr Mechanismus der Toröffnung ist im Vergleich zum HbYX-abhängigen Mechanismus relativ gut bekannt. Sie assoziieren mit dem 20S und nutzen ihre C-Termini, um in den α-Intersubunit-Taschen anzudocken, ähnlich wie die HbYX-abhängigen Aktivatoren. Um jedoch die Gate-Öffnung auszulösen, ist die 11S-Familie auf „Aktivierungsschleifen“ angewiesen, die direkt mit der Basis der Gating-N-Termini in der Pore des α-Rings verbunden sind22,23. Diese Aktivierungsschleifen scheinen ein Reverse-Turn-Prolin (Pro17) an der Basis der Gating-Reste sterisch abzustoßen und es um <1 Å zu verschieben, was ausreicht, um den geschlossenen Zustand zu unterbrechen und den offenen Zustand zu stabilisieren9. Interessanterweise sind minimale Konformationsänderungen in den α-Untereinheiten (mit Ausnahme der Gating-Regionen) für die Gate-Öffnung durch die 11S-Aktivatoren erforderlich, wie die Kristallstruktur des PA26-20S-Proteasoms zeigt9. Es ist offensichtlich, dass die beiden Familien von PAs (HbYX-abhängig und HbYX-unabhängig) unterschiedliche Strategien verwenden, um die 20S-Toröffnung zu induzieren. Der regulatorische ATPase-20S-Komplex und sein HbYX-Motiv für die Bindung und Toröffnung sind jedoch in allen Organismen mit Proteasomen, einschließlich Archaeen und Eukaryoten, konserviert. Basierend auf dieser strukturellen und funktionellen Erhaltung gehen wir davon aus, dass der HbYX-abhängige Mechanismus der Toröffnung auch in archaealen und eukaryontischen 20S-Proteasomen erhalten bleibt. Obwohl der Ort und die Wirkung der HbYX-Bindung untersucht wurden, scheint der molekulare Mechanismus der HbYX-abhängigen Gate-Öffnung überraschend komplex zu sein und bleibt ungelöst.

Kürzlich haben wir gezeigt, dass ND-assoziierte Proteine (z. B. Amyloid-β, α-Synuclein und Huntingtin) sich in eine gemeinsame Konformation falten können, die 20S- und 26S-Proteasomen hemmt21. Wir haben auch erfahren, dass diese löslichen Oligomere (A11+) die 20S hemmen, indem sie die Konformation des geschlossenen Gates allosterisch stabilisieren21. Diese negative allosterische Regulation durch solche toxischen24 Oligomere scheint mechanistisch mit dem HbYX-abhängigen Mechanismus der 20S-Gate-Öffnung gekoppelt zu sein21, was darauf hindeutet, dass diese Oligomere und das HbYX-Motiv allosterische Regulatoren desselben Gating-Mechanismus sind. Daher gehen wir davon aus, dass die Stimulierung der 20S-Aktivität über den HbYX-abhängigen Mechanismus die Beeinträchtigung durch ND-bezogene Oligomere antagonisiert, was die Proteasomfunktion wiederherstellen und den Proteinabbau stimulieren könnte, wodurch möglicherweise ein therapeutischer Ansatz für ND bereitgestellt wird.

In dieser Studie haben wir ein kleines Molekül entworfen, das den HbYX-Motiv-abhängigen Mechanismus der proteasomalen Toröffnung (hydrophober Tyrosin-variabler C-terminaler Rest) funktionell nachahmt und die Archaeen-, Hefe- und Säugetier-Proteasome robust aktiviert. Mithilfe unseres kleinen Moleküls als Forschungsinstrument klären wir die grundlegenden Voraussetzungen auf, die das HbYX-Motiv benötigt, um die Toröffnung zu induzieren. Darüber hinaus kann dieses proteasomaktivierende kleine Molekül die Hemmung des Proteasoms durch toxische lösliche Proteinoligomere, die an neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind, wie Amyloid-β, α-Synuclein und Huntingtin-Exon1, umkehren.

Das HbYX-Motiv ist hochkonserviert und kommt in Proteasomaktivatoren in Archaeen, Eukaryoten und sogar einigen Actinobakterien vor (Abb. 1a – c). Durch Mutagenese und Strukturanalysen haben wir herausgefunden, dass die Taschen zwischen den Untereinheiten mehrere konservierte Reste enthalten, von denen einige bereits als wichtig für die Gate-Aktivierung bekannt sind (z. B. Pro17, Lys66 aus Thermoplasma acidophilum)9,16,25 (Abb. 1d). Um besser zu verstehen, wie das HbYX-Motiv mit dem 20S interagiert, haben wir HbYX-gebundene Intersubunit-α-Taschen aus menschlichen (PDB 6msk, Kryo-EM), Hefe- (PDB 4v7o, Kristallographie) und archaealen Proteasomen (PDB 6hed, Kryo-EM) ausgerichtet. (Abb. 1b, c). Wir haben in diesen Strukturen beobachtet, dass das HbYX-Motiv dieser drei verschiedenen Spezies in sehr ähnlichen Orientierungen an die 20S-Interuntereinheitstaschen bindet, mit drei unterschiedlichen und gemeinsamen Wechselwirkungen (Abb. 1c – e): (1) Die C-terminale Carbonsäure der Das Motiv ist auf das konservierte Lysin (K66 in Archaeen) gerichtet, von dem bereits bekannt ist, dass es für die Bildung des 20S-Proteasom-Aktivator-Komplexes erforderlich ist. (2) Die Hydroxylgruppe des vorletzten Tyrosins geht Wasserstoffbrücken mit dem Rückgrat-Carbonyl von G19 ein und ist darauf ausgerichtet Prolin-Reverse-Turn (befindet sich an der Basis des Gates) und (3) die hydrophobe (Hb) Gruppe kontaktiert eine hydrophobe Tasche in der benachbarten α-Untereinheit.

Wir untersuchten den Effekt der Mutation von drei der konservierten Reste, die für die Wechselwirkung mit dem HbYX-Motiv (Abb. 1f) im T. acidophilum 20S (T20S) positioniert sind. Wir haben uns für T20S entschieden, weil es ein symmetrisches Homoheptamer ist, das die gleichzeitige Mutagenese in allen 7 Taschen zwischen den Untereinheiten ermöglicht. Anschließend testeten wir die Aktivierung der T20S-Mutanten durch PAN (Messung des LFP-Nonapeptidabbaus), da PAN den HbYX-abhängigen Mechanismus verwendet (Abb. 1f). In Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Ergebnissen16 verhinderte die K66A-Mutation die PAN-Aktivierung des T20S. Die Grundaktivität von T20S-K66A war ähnlich wie beim Wildtyp (WT). Strukturstudien zeigten, dass der aliphatische Teil der K33-Seitenkette und L81 auf beiden Seiten des HbYX-Tyrosinrings positioniert sind und hydrophob interagieren, um den HbYX-Tyrosinring an Ort und Stelle zu halten (Abb. 1e). Als K33 zu Glycin mutiert wurde, konnte das mutierte T20S nicht mehr durch PAN stimuliert werden (Abb. 1f). Außerdem betrug die Basalaktivität von T20S-K33G etwa die Hälfte des Wildtyps. In ähnlicher Weise verhinderte die Mutation L81A (direkt unter dem HbYX-Tyrosin) die PAN-vermittelte Proteasomaktivierung. Während unsere primäre Interpretation der bisher beschriebenen Ergebnisse darin besteht, dass unsere Mutationen (K66A, K33G usw.) die Aktivierung durch PAN und/oder das Öffnen des Gates verhindern, ist eine alternative Interpretation, dass die Mutationen einfach die Bindung von PAN an T20S verhindern könnten. Das Fehlen einer stabilen Bindung zwischen T20S und PAN schränkt jedoch unsere Fähigkeit ein, experimentell zwischen den beiden Interpretationen zu unterscheiden. Basierend auf früheren Strukturen und diesen biochemischen Ergebnissen kommen wir daher zu dem Schluss, dass K33 und L81 beide wichtig für die Stabilisierung und wahrscheinlich auch die Ausrichtung des HbYX-Tyrosins in der Tasche zwischen den Untereinheiten sind.

In Anbetracht der Bedeutung der HbYX-Tyrosin-Wasserstoffbindung mit dem Rückgrat-Carbonyl von G19 untersuchten wir, ob der Ersatz von L81 (L81Y) durch Tyrosin den Effekt eines gebundenen HbYX-Motivs nachahmen könnte, da die Mutation einen Tyrosinring in einem ähnlichen Raum wie das HbYX-Tyrosin platzieren würde (Abb. 1g, h). Wir fanden heraus, dass Proteasomen mit der L81Y-Mutation (T20S-αL81Y) im Vergleich zum WT eine erhöhte Basalaktivität aufwiesen (Abb. 1g), was darauf hindeutet, dass die bloße Platzierung eines Tyrosins an dieser Stelle ausreicht, um die Gate-Öffnung teilweise zu induzieren, ähnlich wie bei der HbYX-Bindung . In Übereinstimmung mit dieser Schlussfolgerung führte die Zugabe von PAN in Sättigungskonzentration zu T20S-αL81Y-Proteasomen zu einem weiteren Anstieg der Aktivierung um 30 % auf eine nahezu WT-ähnliche Aktivierung (Abb. 1g), was darauf hinweist, dass das L81Y-Tor allein durch Mutation nicht vollständig geöffnet wurde . Diese Ergebnisse zeigen, dass die richtige Platzierung eines Tyrosins allein in allen Taschen zwischen den Untereinheiten des archaealen 20S-Proteasoms ausreicht, um Konformationsänderungen zu induzieren, die zu einer zumindest teilweisen Öffnung des 20S-Tors führen.

Da die L81Y-Mutation in der Lage war, eine teilweise Öffnung des Tors zu induzieren, stellten wir die Hypothese auf, dass kleine Peptide, die das HbYX-Motiv imitieren, die Öffnung des 20S-Tors aktivieren könnten. Unsere vorherige Studie aus dem Jahr 2007 zeigte, dass nur Peptide mit einer Länge von >7 Resten und einem C-terminalen HbYX-Motiv (entsprechend dem C-Terminus des PAN) die Toröffnung induzieren können16. Dies wurde jedoch mit Peptiden festgestellt, die unmodifizierte N-Termini aufwiesen. Wir vermuteten, dass der geladene N-Terminus die Bindung kürzerer HbYX-Peptide an die α-Taschen zwischen den Untereinheiten verhindern könnte. Um diese Hypothese zu testen, synthetisierten wir dieselben Peptide, die dem PAN-C-Terminus mit einer Länge von drei bis acht Resten (CT3-8) entsprechen, außer mit einem acetylierten N-Terminus. N-acetylierte PAN-C-Terminus-Peptide, die kürzer als sieben Reste sind, aktivierten die 20S (Abb. 2a). Bemerkenswerterweise beobachteten wir, dass N-acetyliertes PAN-C-Terminus-Peptid mit einer Länge von sechs Resten (CT6) die 20S mehr als zehnmal stärker aktivierte als die Kontrolle; Sogar das 3-Reste-Peptid (CT3) hatte eine (~2-fache) Gate-Öffnungsaktivität (Abb. 2a).

a N-terminal acetylierte Peptide (200 µM) wurden mit 7 nM WT T20S-Proteasomen und LFP inkubiert. Die Stimulierung der Gate-Öffnung wurde durch den Anstieg der LFP-Hydrolyse (rfu/min) im Vergleich zu WT 20S mit DMSO gemessen. Es werden Sequenzen von Peptiden gezeigt. b Dosisreaktion von Peptiden (Ac-LYR, AC-LYA, ZYA) mit 7 nM WT T20S-Proteasomen und LFP. Die LFP-Abbaurate (rfu/min) ist auf DMSO normiert. c Struktur des ZYA-Peptid-Mimetikums. d ZYA (2,5 mM), inkubiert mit 7 nM WT oder K66A T20S und LFP. LFP-Abbaurate (rfu/min), normalisiert auf DMSO. e ZYA (2,5 mM), inkubiert mit 7 nM WT oder Gateless (α∆N) T2S0 und LFP. LFP-Abbaurate (rfu/min), normalisiert auf αΔN. Die Daten (Mittelwerte) sind repräsentativ für drei oder mehr unabhängige Experimente, die jeweils in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Fehlerbalken stellen ± Standardabweichung dar.

Basierend auf der erfolgreichen Gate-Aktivierung von PAN CT3 (Ac-LYR) nach einer einzigen Modifikation (acetylierter N-Terminus) untersuchten wir, ob zusätzliche Modifikationen die Wirksamkeit des Peptids weiter verbessern würden. Unsere vorherige Studie hat gezeigt, dass der Ersatz von Arginin durch Alanin keinen Einfluss auf die Wirksamkeit des PAN-CT8-Peptids bei der Bindung von α-Intersubunit-Taschen und der Öffnung des Gates hat16. Wir haben daher den sperrigen Argininrest durch ein Alanin ersetzt, was im Vergleich zu Ac-LYR zu einer höheren aktivierenden Wirksamkeit führte (Abb. 2b). Um die Größe des Moleküls weiter zu minimieren, wählten wir Carboxybenzyl (Z) als N-terminale Blockierungsgruppe, die die N-terminale Ladung eliminieren und die Hb-Gruppe (des HbYX-Motivs) nachahmen könnte. Die Kombination dieser Modifikationen führte zu einem Dipeptid mit einer hydrophoben Gruppe vor dem N-Terminus von Tyrosin (Z-Tyr-Ala oder ZYA) (Abb. 2c). Wir verglichen ZYA mit Ac-LYR und Ac-LYA und beobachteten signifikante Verbesserungen bei der T20S-Aktivierung (Abb. 2b). ZYA konnte die T20S-Aktivität erheblich aktivieren, seine Affinität war jedoch gering (siehe unten). Während ZYA T20S etwa 13-fach aktivieren konnte, konnte es die Gate-Öffnung in T20S-K66A in keinem Maße stimulieren (Abb. 2d), was zeigt, dass ZYA wie erwartet K66 in der Tasche zwischen den Untereinheiten benötigt. Dies deutet darauf hin, dass die Aktivierung von T20S durch ZYA über ähnliche Interaktionen erfolgt wie die, die für die Aktivierung durch PAN verantwortlich sind. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass ZYA die Proteasestellen aktiviert, anstatt die Gate-Öffnung zu induzieren, haben wir auch die Fähigkeit von ZYA getestet, das αΔN-T20S zu stimulieren, dem Gate-Reste fehlen und das konstitutiv offen ist. ZYA stimulierte die Aktivität von αΔN-T20S in keinem Maße (Abb. 2e). Zusammengenommen stimmen diese Ergebnisse damit überein, dass ZYA die 20S aktiviert, indem es die Toröffnung induziert, ähnlich dem HbYX-Motiv, auf dem es basiert.

Wir wollten herausfinden, ob sich unsere Erkenntnisse mit ZYA zum Thermoplasma 20S auf das Säugetiersystem übertragen lassen; Daher haben wir Ac-LYR, Ac-LYA und ZYA auf M20S getestet (ergänzende Abbildung 1a). In Übereinstimmung mit den T20S-Ergebnissen beobachteten wir mit jeder Modifikation eine signifikante Verbesserung der Gate-Öffnungswirksamkeit. ZYA zeigte den größten Effekt auf M20S, und eine Konzentrationsreaktion mit ZYA zeigte eine fast 50-fache Aktivierung bei Sättigungsniveaus (Abb. 3a vs. ergänzende Abb. 1a). Obwohl ZYA die M20S-Aktivität stark stimulieren kann, weist es eine geringe Affinität mit einem Kobs von ~1 mM auf (Abb. 3a), was seiner Affinität für T20S (Abb. 2b) sehr ähnlich ist. Um zu bestätigen, dass ZYA durch Toröffnung in eukaryotischen Proteasomen aktiviert wird, fragten wir, ob ZYA den Hefe-Offenkanal-Mutanten (α3∆N) 20S aktivieren könnte. Wir fanden heraus, dass ZYA es überhaupt nicht aktivieren konnte, aber erwartungsgemäß WT-Hefe 20S (Y20S) aktivierte (Abb. 3b), was mit analogen Experimenten im Archaeensystem übereinstimmt. Interessanterweise ergab die Sättigungskurve für die ZYA-induzierte Proteasomaktivität für M20S eine kooperative Bindungskurve mit einem signifikanten Hügelkoeffizienten von 1,5 ± 0,1 (Abb. 3a). Dies weist darauf hin, dass die ZYA-Bindung kooperativ ist und dass die Bindung an mehr als eine Stelle während der allosterischen Induktion der Toröffnung erfolgt. Dies steht im Einklang mit veröffentlichten Kryo-EM-Strukturen des 26S18,19, die mehrere C-Termini-Bindungen zeigten, bevor der Open-Gate-Zustand vollständig stabilisiert war. Während die minimale Anzahl von HbYX-Motiven, die zum Induzieren der Gate-Öffnung erforderlich sind, unbekannt ist, deutet der Hügelkoeffizient von 1,5 darauf hin, dass eine Mindestbindung von zwei Molekülen beteiligt ist. Alternativ beeinflusst die erste Bindung des HbYX-Motivs an eine beliebige Tasche zwischen den Untereinheiten des T20S die Bindung der zweiten Bindung des Motivs am α-Ring der gegenüberliegenden Seite des T20S. Allerdings ist die Allosterie benachbarter Untereinheiten plausibler, da die Bindung der 26S-ATPasen alle an benachbarten Taschen in einem einzelnen α-Ring erfolgt.

a Dosis-Wirkung von ZYA mit 20S-Proteasomen von Säugetieren (0,5 nM) und nLPnLD-AMC als Substrat. Die Proteasomaktivität wird auf DMSO-Kontrolle normalisiert. Die Mittelwerte wurden an die Hill-Gleichung angepasst und die Gleichgewichtsbindungskoeffizienten werden angezeigt. b WT und torlose (α3∆N) Hefe-20S-Proteasome (0,5 nM), inkubiert mit oder ohne ZYA (2,5 mM) und nLPnLD-amc. c Säugetier-20S-Proteasomen (0,5 nM) allein oder mit ZYA (2,5 mM) oder PA26 (55 nM) oder beiden (siehe Diagrammschlüssel). Proteasom-Aktivität gemessen unter Verwendung von drei verschiedenen fluorogenen Substraten, die bevorzugt durch verschiedene 20S-Proteasestellen gespalten werden (LLVY-amc, Chymotrypsin-ähnlich, nLPnLD-amc, Caspase-ähnlich; LRR-amc, Trypsin-ähnlich). Die Daten (Mittelwerte) sind repräsentativ für drei oder mehr unabhängige Experimente, die jeweils in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Fehlerbalken stellen ± Standardabweichung dar.

Als nächstes testeten wir die Fähigkeit von ZYA, M20S zur Hydrolyse von drei verschiedenen Peptidsubstraten zu stimulieren, die bevorzugt von den drei verschiedenen Proteasestellen von 20S gespalten werden (suc-LLVY-amc, β5; Ac-nLPnLD-amc, β1; Boc-LRR-amc, β2). Wir beobachteten einen signifikanten 10- bis 50-fachen Anstieg der Hydrolyserate aller drei Peptidsubstrate (Abb. 3c im Vergleich zu DMSO), was für einen Toröffner zu erwarten ist. Um festzustellen, wie gut ZYA das Öffnen des Tors induzieren konnte, verglichen wir es außerdem mit der M20S-Aktivierung durch PA26. Sättigende PA26-Konzentrationen stimulieren die M20S-Aktivität typischerweise um das 30- bis 100-fache, abhängig von der Grundaktivität des 20S-Präparats. Wir fanden heraus, dass ZYA das M20S ähnlich wie PA26 stimulieren konnte: etwa 50-fache Aktivierung durch ZYA und etwa 90-fache für PA26 (für Ac-nLPnLD-AMC). Darüber hinaus gab es keine Synergie zwischen diesen Aktivatoren, als wir ZYA und PA26 in einer einzigen Reaktion kombinierten. Stattdessen kam es im Vergleich zu PA26 allein zu einem leichten Rückgang der Aktivität, was wahrscheinlich auf die erwartete Konkurrenz zwischen ZYA und der Bindung von PA26 an die Taschen zwischen den Untereinheiten zurückzuführen ist. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass ZYA ein hochwirksamer und robuster Toröffnungsaktivator des M20S-Proteasoms aus Archaeen, Hefen und Säugetieren ist. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass dieses HbYX-Peptid-Mimetikum analog zum hochkonservierten HbYX-Motiv funktioniert.

Wir haben gezeigt, dass ZYA die Peptidhydrolyse durch Toröffnung robust aktiviert, aber wie sieht es mit der Fähigkeit von 20S aus, unstrukturierte Proteine abzubauen? Um diese Frage zu beantworten, fragten wir, ob ZYA das M20S-Proteasom dazu anregen könnte, Tau23 (ein verkürztes Tau-Protein, das im Gehirn vorkommt) und das unstrukturierte Modellprotein Kasein abzubauen. ZYA erhöhte den Abbau beider Proteine deutlich, wie durch SDS-PAGE mit Coomassie-Färbung sichtbar gemacht wurde (Abb. 4a, b). Tau und Kasein schienen innerhalb der ersten 15 bzw. 30 Minuten vollständig abgebaut zu sein. Zur Untermauerung dieser Ergebnisse haben wir auch die Peptide gemessen, die durch den Abbau von 14C-Casein durch die 20S in Lösung entstehen (Abb. 4c), gemessen durch säurelösliche Zählungen. In Übereinstimmung mit dem gelbasierten Proteinabbautest erhöhte ZYA die Anzahl der löslichen Peptide aus dem Abbau von 14C-Casein deutlich. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass ZYA den Abbau ungefalteter Proteine stark stimulieren kann.

a Säugetier-20S-Proteasome (100 nM), inkubiert mit Tau23 (2 uM). Zu den angegebenen Zeiten wurde die Reaktion durch Zugabe von SDS-Ladepuffer gelöscht und durch SDS-PAGE aufgetrennt. Mit Coomassie-Brillantblau visualisierte Proteine. Die Gele sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. 20S-Proteasom-Untereinheiten sind mit Klammern gekennzeichnet, um als Ladekontrollen für jede Probe zu dienen. b Wie a, außer mit β-Kasein (1 uM). c 14C-Kasein wurde mit dem 20S-Proteasom von Säugetieren ähnlich wie D 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die säurelöslichen Zählungen nach der TCA-Fällung wurden mittels Szintillation quantifiziert, um die Bildung von Peptidprodukten zu zeigen. p-Wert: 0,011. Die Daten (Mittelwerte) sind repräsentativ für drei oder mehr unabhängige Experimente, die jeweils in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Fehlerbalken stellen ± Standardabweichung dar.

Um zu klären, wie ZYA an das menschliche Proteasom bindet, haben wir ZYA rechnerisch in der menschlichen α5/6-Interuntereinheitstasche angedockt, wo das HbYX-Motiv von Rpt5 bindet. Unsere Docking-Ergebnisse (Abb. 5a) legen nahe, dass ZYA in einer ähnlichen Konfiguration wie das HbYX-Motiv verschiedener PAs bindet (Abb. 1c). Um die Spezifität und die HbYX-motivähnlichen Anforderungen von ZYA für das M20S zu bewerten, untersuchten wir die Struktur-/Funktionsbeziehungen und die Wirksamkeit von ZYA durch chemische Modifikationen (Abb. 5b – d). Zunächst fragten wir, ob zusätzliche negative Ladungen in der „X“-Position des HbYX-Motivs durch den Ersatz von Alanin durch saure Reste toleriert werden könnten. Wir fanden heraus, dass ZYE und ZYD den M20S nicht aktivieren konnten (Abb. 5b). Wir haben auch getestet, ob die Verursachung einer Rückgrat-Torsionsbeschränkung (ZYP) und einer polaren Gruppe (ZYQ) die Struktur und Bindung des Peptids stabilisieren könnte, aber auch sie haben die M20S-Stimulationsaktivität aufgehoben (Abb. 5b). Frühere Studien und Sequenzkonservierungen zeigten, dass kleine, mittlere und große aliphatische und basische Reste alle in der „X“-Position toleriert werden konnten, daher die Bezeichnung „X-Variable“16. Unsere Daten mit der ZYA deuten auch darauf hin, dass es in dieser Position einige Einschränkungen (z. B. negative Ladungen) gibt. Frühere Studien9,16,25 zeigten auch, dass die terminale Carboxygruppe des HbYX-Motivs eine ionische Bindung mit K66 eingeht. Um zu bestätigen, dass dies für die ZYA-Funktion in M20S wichtig ist, blockierten wir das Carboxyl am C-Terminus mit einer NOH2-Gruppe (ZYA-[NOH2]). Durch die Carboxyblockierung wurde die ZYA-Aktivität vollständig aufgehoben (Abb. 5b), wie für die kanonische HbYX-Motivfunktion erwartet. Als nächstes betrachteten wir die Überbrückung der Tasche zwischen den Untereinheiten durch ZYA (dh die Bindung zwischen G19 oder einer Untereinheit und K66 der benachbarten Untereinheit, Abb. 5a), wie durch die Bindung des Motivs in veröffentlichten Strukturen und unser angedocktes Modell (Abb. 5a) nahegelegt ), könnte dazu beitragen, Konformationsänderungen hervorzurufen, die eine Toröffnung bewirken. Um diese Hypothese im M20S zu testen, haben wir das Tyrosin von ZYA modifiziert, um den „Brücken“-Abstand zu verlängern, indem wir dem Tyrosinhydroxyl eine Nitro- oder Phosphogruppe hinzugefügt haben, was den Brückenabstand um 1 bzw. 2 Bindungen verlängern würde (Abb. 5c). . Sowohl ZpYA als auch Z(nitro-Tyr)A konnten die 20S nicht aktivieren (Abb. 5d), was die erforderliche Brückenlänge zwischen den Tyrosinhydroxyl- und Carboxy-C-Termini von ZYA unterstützt. Diese Schlussfolgerung wird weiter durch die Tatsache gestützt, dass Z(4-Amino-Phe)A die 20S immer noch in einem ähnlichen Ausmaß wie ZYA aktiviert (Abb. 5d), da es eine ähnliche Brückenlänge wie ZYA aufweist.

ein ZYA (grüne Stäbchen), das in der Intersubunit-Tasche zwischen α5 und 6 im menschlichen 20S angedockt ist. In PyMOL gerendertes Bild. b Säugetier-20S-Proteasom-Aktivität (0,5 nM) (nLPnLD-amc-Hydrolyse, rfu/min) mit den angegebenen ZYA-Derivaten (500 μM) mit Variationen in der „X“-Position, die sich als schädlich für die ZYA-Aktivität erwiesen haben. Die Proteasomaktivität ist auf DMSO normalisiert. c Strukturen der in (d) getesteten Derivate. d 20S-Proteasomaktivität bei Säugetieren (nLPnLD-amc-Hydrolyse, rfu/min) mit den angegebenen ZYA-Derivaten bei einer niedrigen Bindungskonzentration von 100 μM. Die Proteasomaktivität ist auf DMSO normalisiert. Die Daten (Mittelwerte) sind repräsentativ für drei oder mehr unabhängige Experimente, die jeweils in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Fehlerbalken stellen ± Standardabweichung dar.

Kürzlich wurden mehrere Studien zum Potenzial kleiner Moleküle zur Aktivierung des 20S-Proteasoms veröffentlicht, obwohl ihre Aktivierungsmechanismen noch nicht klar sind. Wir verglichen die Leistung von ZYA, das das HbYX-Motiv nachahmen soll, im Vergleich zu einigen dieser kleinen Moleküle (AM-404, TCH-165, Fluspirilene (FLP)26,27). Die anderen kleinen Moleküle zeigten im Vergleich zu ZYA eine höhere Bindungsaffinität (mit Kobs-Werten im mikromolaren Bereich; Tabelle 1, ergänzende Abbildung 1b). Wie aus den Vmax-Werten hervorgeht, aktivierte jedoch keiner von ihnen das M20S in dem Maße, wie ZYA selbst bei Sättigungskonzentrationen dazu in der Lage war (Tabelle 1; ergänzende Abbildung 1b). Interessanterweise aktivierte keine der anderen Verbindungen T20S oder eine seiner Varianten (z. B. WT, αΔN, K66A) signifikant (ergänzende Abbildung 2). Bemerkenswerterweise aktiviert ZYA WT T20S, jedoch nicht T20S-αΔN oder T20S-K66A, wie für eine HbYX-nachahmende Verbindung erwartet. Dies weist darauf hin, dass ZYA über den konservierten HbYX-abhängigen Mechanismus funktioniert, während die anderen hier getesteten Verbindungen offenbar nicht über diesen konservierten Mechanismus funktionieren, da sie das archaeale 20S nicht beeinflussen. Die Fähigkeit eines kleinen Moleküls wie ZYA, das Proteasom fast 50-fach mit ähnlicher Wirksamkeit wie der multimere PA26 11S-Aktivator zu aktivieren, ist unseres Wissens nach beispiellos.

Wir haben kürzlich eine Studie veröffentlicht, die zeigt, dass lösliche Oligomere von Amyloid-β (Aβ), α-Synuclein und Huntingtin (Q53), die eine gemeinsame Tertiärkonformation (A11+) haben, die 20S-Funktion allosterisch hemmen, indem sie die Closed-Gate-Konformation stabilisieren21. Da ZYA die Toröffnung stimuliert, untersuchten wir die Möglichkeit, dass es auch M20S vor der Hemmung durch diese neurodegenerativen Oligomere retten könnte. Bemerkenswert ist, dass bei der Messung der M20S-Aktivität in Gegenwart von Oligomeren die Zugabe von 1 mM ZYA die Hemmung durch A11 + Aβ-, α-Synuclein- und Huntingtin(Q53)-Oligomere vollständig blockiert (Abb. 6a–c). Darüber hinaus stimuliert ZYA selbst bei 50 μM das Aβ-Oligomer-inhibierte M20S ausreichend, um seine Grundaktivität wieder auf das WT-Niveau zu bringen (vergleichen Sie die Kontrolle ohne ZYA mit Aβ-Oligomeren bei 50 μM ZYA) (Abb. 6a). Dies ist ein eindeutiger Beweis für das Potenzial kleiner Moleküle, die Proteasomaktivität bei M20S-Beeinträchtigungen wiederherzustellen. Darüber hinaus könnten Verbindungen, die wie ZYA funktionieren, auch den Abbau von intrinsisch ungeordneten Proteinen (IDPs) fördern (Abb. 7), bei denen es sich häufig um die zur Aggregation neigenden Proteine handelt, die an neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind28,29,30.

A. 20S-Proteasom-Aktivität (0,5 nM) (nLPnLD-amc-Hydrolyse, rfu/min) mit ZYA in den angegebenen Konzentrationen, mit und ohne Aβ-Oligomere (0,5 μM) Oligomere21. Die Geschwindigkeit der nLPnLD-amc-Hydrolyse wird auf die Kontrolle normalisiert. B. 20S-Proteasome, inkubiert mit und ohne α-Syn (oben) und mit oder ohne ZYA (1 mM). Die Geschwindigkeit der nLPnLD-amc-Hydrolyse wird auf die Kontrolle normalisiert. C. Wie b, außer mit HttQ53-Oligomeren. Die Geschwindigkeit der nLPnLD-amc-Hydrolyse ist auf die Kontrolle normiert. Die Daten (Mittelwerte) sind repräsentativ für drei oder mehr unabhängige Experimente, die jeweils in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Fehlerbalken stellen ± Standardabweichung dar.

Kleine Moleküle, die ähnlich wie ZYA funktionieren, haben das Potenzial, in zwei verschiedenen vorteilhaften Stadien des Proteinabbaus zu wirken: (1) den Abbau unstrukturierter Proteine, die sich fehlfalten, oligomerisieren, aggregieren und toxisch werden könnten, hochzuregulieren und (2) wiederherzustellen Die normale Proteasomfunktion wird auf Proteasome übertragen, die durch toxische Oligomere beeinträchtigt werden könnten.

Proteinopathien werden mit vielen verschiedenen Erkrankungen des Menschen in Verbindung gebracht (z. B. Alzheimer-Krankheit, Kardiomyopathien und Typ-II-Diabetes) und sind durch die Ansammlung intrazellulärer (und manchmal extrazellulärer) fehlgefalteter Proteine gekennzeichnet. Viele dieser fehlgefalteten Proteinopathie-assoziierten Proteine sind IDPs31,32,33, die durch das 20S-Proteasom in vitro effizient abgebaut werden. Warum die Proteinabbausysteme der Zellen nicht ausreichen, um die intrazellulären Proteine in NDs abzubauen, ist nicht klar, obwohl berichtet wurde, dass viele NDs trotz relativ normaler Mengen an zellulären Proteasomen eine ungewöhnlich niedrige proteasomale Aktivität aufweisen2. Tatsächlich wird seit Jahrzehnten in der Forschung eine Beeinträchtigung des Proteasomsystems mit der Ätiologie von NDs wie Alzheimer und Parkinson in Verbindung gebracht3,4,5,6,7, obwohl die spezifischen Ursachen noch unklar sind. Die Funktion des UPS ist entscheidend für die gesunde Aufrechterhaltung des Proteoms im Allgemeinen und insbesondere für die neuronale Synapsenfunktion (dh Plastizität und synaptischer Proteinumsatz)1,31.

Basierend auf unseren früheren Erkenntnissen zur Oligomerbeeinträchtigung21 haben wir den ersten mehrzelligen Organismus (C. elegans) mit einem konstitutiv offenen 20S-Proteasom erzeugt, der durch diese toxischen Oligomere32 nicht gehemmt werden konnte. Diese Würmer mit „hyperaktiven“ 20S-Proteasomen haben eine erhöhte Langlebigkeit und Widerstandsfähigkeit gegenüber verschiedenen Proteotoxizitäten, einschließlich Hitzeschock und oxidativen Schäden. Darüber hinaus hat sich die Erhöhung der Proteasommenge oder -aktivität in Säugetierzellkulturen und mehrzelligen Organismen auf verschiedene Weise als machbar erwiesen und den Abbau von endogenen und ND-bezogenen Proteinen erhöht32,33,34,35,36,37. Zusammengenommen motivierten diese Ergebnisse die aktuelle Studie, die pharmakologische Anwendbarkeit dieses Mechanismus weiter zu bestimmen, um möglicherweise die oben genannten pathologischen Proteinopathien zu behandeln.

Diese Ergebnisse unterstreichen die Plausibilität einer robusten Aktivierung des Säugetier-Proteasoms mithilfe eines kleinen Moleküls, das die einfachsten und grundlegendsten Aspekte des HbYX-Motivs nachahmen soll. Darüber hinaus zeigen die Daten deutlich, dass zum Auslösen der Toröffnung im 20S-Proteasom keine komplexen Wechselwirkungen mit großen Ring-Proteasom-Aktivatoren erforderlich sind. Stattdessen kann die Gate-Öffnung allosterisch durch kleine Modulatoren (z. B. das HbYX-Motiv) induziert werden, die sich innerhalb der Taschen zwischen den Untereinheiten vom Gate wegbinden und dabei insbesondere K66 erfordern. Somit legt diese Studie den Grundstein für das Verständnis der elementaren molekularen Komponenten des HbYX-Motivs, die für seine Funktion als hochkonservierter „Schlüssel“ zum Öffnen des 20S-Tors von entscheidender Bedeutung sind. Diese Erkenntnisse führen auch zu Größenbeschränkungen für die Bindungstaschen in den Zwischenräumen zwischen den Untereinheiten, die für die Regulierung des allosterischen Tors erforderlich sind. Dadurch werden die wesentlichen Wechselwirkungen auf drei kleine Bereiche reduziert, die mit dem Hb, den Y-Seitenketten und der Carboxylgruppe des X-Rests interagieren.

Unsere Ergebnisse hier zeigen, dass ZYA selbst bei Konzentrationen, die weit unter der Sättigung liegen, die Proteasomhemmung durch drei verschiedene ND-verwandte Proteine wirksam umkehrt (Abb. 6). Diese Hemmungsumkehr ist offensichtlich auf die Fähigkeit von ZYA zurückzuführen, die Toröffnung in HbYX-abhängiger Weise zu stimulieren. Wir gehen davon aus, dass Verbindungen, die in ähnlicher Weise die Toröffnung bei physiologisch relevanteren Affinitäten induzieren könnten, möglicherweise ND behandeln könnten (Abb. 7). Solche Verbindungen könnten sowohl den Abbau der meisten ND-bezogenen Proteine, bei denen es sich typischerweise um IDPs handelt, stimulieren, als auch gleichzeitig die beim Altern beobachtete Beeinträchtigung des Proteasoms umkehren. Fortschritte beim Verständnis der Gate-Regulationsmechanismen des Proteasoms bieten einen Rahmen für die Entwicklung kleiner Moleküle, die der Beeinträchtigung des Proteasoms, insbesondere durch Oligomere, entgegenwirken oder dessen Fähigkeit zum Abbau unstrukturierter Proteine aktivieren21. Angesichts der Bedeutung des proteasomalen Gates für die Regulierung des Proteinabbaus haben Gate-aktivierende Verbindungen (wie ZYA) ein vielversprechendes Potenzial als Forschungsinstrumente zur Untersuchung der Proteasomfunktion in vitro und möglicherweise in vivo, um möglicherweise die Rolle der Proteasombeeinträchtigung beim Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen aufzuklären .

T.acidophilum-Wildtyp (WT) 20S, Δα2-12 und alle anderen mutierten 20S-Proteasomen wurden auf ähnliche Weise wie beschrieben38 gereinigt, außer über 8XHis-Tags am C-Terminus der β-Untereinheit. Alle 20S-Mutanten wurden durch überlappende ortsspezifische PCR-Mutagenese erzeugt. Dem Plasmid für M.jannaschii PAN(M74A), freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Peter Zwickl39, fehlte ein 6His-Tag und es wurde wie beschrieben23 gereinigt, aber Tris-Puffer wurden bei 50 mM statt 20 mM hergestellt. 20S-Proteasomen von Säugetieren wurden wie beschrieben aus Rinderleber isoliert40. WT- und mutierte α3ΔN-Hefe-20S-Proteasomen wurden wie beschrieben exprimiert und durch Anionenaustauschchromatographie gereinigt41.

Fluorogene Substratpeptide wurden von BostonBiochem (suc-LLVY-amc) und EZBiolabs (ac-nLPnLD-amc, ac-RLR-amc, LFP (Mca-AKVYPYPME-Dpa(Dnp)-amid)), PAN CT-Peptide, ZYA, erworben. und ZYA-Derivate wurden von ABclonal synthetisiert. Verbindungen (AM-404, TCH-165, Fluspirilene (FLP)) wurden von Cayman Chemical gekauft. Peptide und chemische Verbindungen wurden in DMSO gelöst und mit Proteasomen in den angegebenen Konzentrationen inkubiert. Die Endkonzentration von DMSO in Aktivitätstests betrug 2 %. Oligomere von Aβ*56, α-Synuclein und Huntingtin-Q53 wurden wie beschrieben hergestellt21. Alle verwendeten Oligomere wurden vom α-Oligomer-Antikörper A1142 erkannt. Die Proteinkonzentrationen wurden mittels Bradford-Assay (Thermo Scientific) bestimmt. Zur Messung der Peptidhydrolyse wurden in DMSO gelöste fluorogene Peptide in einer Endkonzentration von 25–100 μM für Suc-LLVY-amc und Ac-nLPnLD-amc und 3–10 μM für LFP und Boc-LRR-amc in 50 verwendet mM Tris (pH 7,5), 1 mM DTT. Für archaeale 20S-Experimente wurden die angegebenen Konzentrationen von T20S und LFP-Peptid dem Puffer bei 45 °C zugesetzt, und wo nicht angegeben, 1 μg PAN und 10 μM ATPγS (+5 mM MgCl2) oder 2 mM ATP und 10 mM MgCl2 , wurde zu 0,1 ml Reaktionspuffer gegeben (ausreichend, um die 20S-Partikel zu sättigen). Die Menge an archaischem 20S aus verschiedenen Reinigungspräparaten wird auf ihre Geschwindigkeit der Suc-LLVY-AMC-Hydrolyse normiert, deren Abbau nicht durch Gating reguliert wird. Tests mit Säugetier- (0,5 nM und 1 nM wie angegeben), Hefe-Wildtyp- (2 nM) und Hefe-α3ΔN-Proteasomen (0,2 nM) wurden bei 37 °C durchgeführt. Tests mit Aβ-, α-Synuclein- und Huntingtin-Q53-Oligomeren wurden wie beschrieben durchgeführt21. Die Tests wurden 30 Minuten bis eine Stunde lang durchgeführt und mit der Datenanalysesoftware BioTek Gen5 analysiert. Die Aktivität wurde als relative Fluoreszenzeinheiten/Minute (rfu/min) gemessen, wodurch eine Kurve erstellt wurde, die zur Berechnung der Anfangsgeschwindigkeit entsprechend der Steigung der Kurven verwendet wurde. Wo „Fold Activation“ angegeben ist, wurde die Fold-Aktivierung berechnet, indem die durchschnittliche Anfangsgeschwindigkeit durch den Durchschnitt der Negativkontrollen dividiert wurde, gegebenenfalls unter Zugabe von DMSO.

Tau23 (Geschenk von Eckhard Mandelkow) oder β-Kasein (Sigma) wurden mit 20S-Proteasomen von Säugetieren für die angegebene Zeit bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von LDS-Probenpuffer (Invitrogen) gelöscht. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE unter Verwendung von NuPAGE™ 4–12 % Bis-Tris-Proteingelen (Invitrogen) aufgetrennt und mit Coomassie-Brilliantblau sichtbar gemacht. Der Abbau von 14C-Casein wurde durch Szintillation der säurelöslichen Zählwerte bewertet, wie in Lit. beschrieben. 42.

Das automatisierte Andocken des ZYA-Peptid-Mimetikums in der Tasche zwischen den Untereinheiten des menschlichen Proteasoms wurde mit Glide aus der Schrödinger Suite43 durchgeführt.

Die Daten wurden in Graph Pad oder Excel unter Verwendung eines ungepaarten Student-t-Tests (Prism) analysiert. Für alle statistischen Analysen wurde ein Wert von p < 0,05 als signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Autoren erklären, dass Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Papier und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar sind und auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich sind. Quelldaten für alle Diagramme, einschließlich einzelner Datenpunkte, finden Sie in einer Excel-Datei mit dem Titel „Supplementary Data“. Die dargestellten, nicht zugeschnittenen Gele in voller Größe sind in der ergänzenden Abbildung 3 zu finden.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken den Mitgliedern des Smith Lab für die hilfreichen und wertvollen Diskussionen. Wir danken unserem Studenten Matthew Dombrowski für seine Unterstützung. Wir danken Dr. Andrew K. Shiemke für die sorgfältige und sorgfältige Durchsicht unseres Manuskripts. Diese Arbeit wurde von NIH-R01AG064188 und R01GM107129 an DMS unterstützt

Abteilung für Biochemie und Molekulare Medizin, West Virginia University School of Medicine, 64 Medical Center Dr., Morgantown, WV, USA

Janelle JY Chuah, Tiffany A. Thibaudeau und David M. Smith

Abteilung für Neurowissenschaften, Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University, Morgantown, WV, USA

David M. Smith

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JJYC reinigte WT, α∆N, K66A T20S und WT und α3∆N Y20S sowie Säugetier-20S und führte Experimente mit acetylierten Peptiden, ZYA, WT, K66A und α∆N T20S, WT und α3∆N Y20S durch. TAT generierte PYMOL-Zahlen, führte eine ZYA-Dosisreaktion durch, testete ZYA-Analoga und führte das Andocken von ZYA im menschlichen Proteasom durch, reinigte Säugetier-20S und bereitete Experimente mit Amyloid-β-, α-Synuclein- und Huntingtin-Oligomeren vor und führte diese durch. DMS reinigte K33G-, L81A-, L81G-, L81Y-, K66A-, T20S- und 14C-Kasein und führte Proteinabbautests durch. Die Ergebnisse wurden von JJYC, TAT und DMS analysiert und interpretiert. Das Manuskript wurde von JJYC und DMS erstellt. Alle Autoren überprüften die Ergebnisse und genehmigten die endgültige Version dieses Manuskripts.

Korrespondenz mit David M. Smith.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Dieses Manuskript wurde zuvor in einer anderen Nature Portfolio-Zeitschrift rezensiert. Das Manuskript wurde ohne weitere Begutachtung bei Communications Biology als zur Veröffentlichung geeignet erachtet. Hauptredakteur: Gene Chong.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chuah, JJY, Thibaudeau, TA & Smith, DM Minimale mechanistische Komponente der HbYX-abhängigen Proteasomaktivierung, die die Beeinträchtigung durch neurodegenerative assoziierte Oligomere umkehrt. Commun Biol 6, 725 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05082-9

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Eingegangen: 20. Juni 2023

Angenommen: 28. Juni 2023

Veröffentlicht: 14. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05082-9

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