Identifizierung von Glykankonsumenten in menschlichen Darmmikrobiotaproben mittels metabolischer Markierung in Verbindung mit Fluoreszenz

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 662 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Zusammensetzung und der Stoffwechsel der menschlichen Darmmikrobiota werden stark von komplexen Glykanen in der Nahrung beeinflusst, die nachgelagerte Auswirkungen auf die Physiologie und Gesundheit der Wirte haben. Trotz der jüngsten Fortschritte in unserem Verständnis des Glykanstoffwechsels durch menschliche Darmbakterien benötigen wir immer noch Methoden, um Glykane mit den sie konsumierenden Bakterien zu verknüpfen. Hier verwenden wir einen funktionellen Assay, um Darmbakterien von gesunden menschlichen Freiwilligen zu identifizieren und zu isolieren, die verschiedene Glykane aufnehmen. Die Methode kombiniert metabolische Markierung mithilfe fluoreszierender Oligosaccharide mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS), gefolgt von Amplikonsequenzierung oder Kulturomik. Unsere Ergebnisse zeigen eine metabolische Markierung in verschiedenen Taxa, wie z. B. Prevotella copri, Collinsella aerofaciens und Blautia wexlerae. Die In-vitro-Validierung bestätigt die Fähigkeit der meisten, aber nicht aller markierten Arten, das für das Wachstum interessante Glykan zu verbrauchen. Parallel dazu zeigen wir, dass Glykankonsumenten aus drei großen Phyla aus Kulturen sortierter markierter Zellen isoliert werden können. Durch die Verknüpfung von Bakterien mit den von ihnen aufgenommenen Glykanen verbessert dieser Ansatz unser grundlegendes Verständnis des Glykanstoffwechsels durch Darmbakterien. Zukünftig könnte es genutzt werden, um Einblicke in den Mechanismus präbiotischer Ansätze zu gewinnen, bei denen Glykane zur Manipulation der Zusammensetzung der Darmmikrobiota eingesetzt werden.

Die Darmmikrobiota ist ein wesentlicher Bestandteil der menschlichen Physiologie, da sie unsere Ernährung verstoffwechselt, essentielle Vitamine und Aminosäuren synthetisiert, das Immunsystem trainiert und uns vor Krankheitserregern schützt1,2,3,4,5. Fortschritte bei genetischen und bioinformatischen Werkzeugen haben zu einem neuen Verständnis der Komplexität und Vielfalt der Darmmikrobiota sowie ihrer Bedeutung bei menschlichen Krankheiten geführt6. Das Darmmikrobiom ist reich an Genen, die an der Glykolyse und dem Kohlenhydratstoffwechsel beteiligt sind2,7. Durch diese kohlenhydrataktiven Enzyme (CAZymes) verstoffwechseln Darmbakterien aus der Nahrung stammende komplexe Glykane (Ballaststoffe), die vom Wirt unverdaut in den Dickdarm gelangen8,9. Folglich ist die Ernährung ein wichtiger Faktor für die Zusammensetzung und Vielfalt der Darmmikrobiota, mehr noch als genetische Faktoren10. Tatsächlich führen Veränderungen in der Ernährung typischerweise zu schnellen mikrobiellen Stoffwechselveränderungen und einer veränderten mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur7,11. Wichtig ist, dass selbst subtile strukturelle Unterschiede bei Glykanen in Studien zur Nahrungsergänzung am Menschen zu unterschiedlichen mikrobiellen Stoffwechselleistungen führen können12.

Unser Verständnis von CAZymes schreitet schnell voran, wie die Charakterisierung von Polysaccharid-Verwertungsorten (PULs) in Bacteroidetes zeigt, wie beispielsweise das Stärkeverwertungssystem (SUS), das in Bacteroides thetaiotaomicron ausführlich untersucht wurde13. Der Sus-Locus kodiert Proteine, die für die Bindung (SusDEF) und den Zelloberflächenabbau (SusG) von Stärkepolysacchariden zu Oligosacchariden verantwortlich sind, die vom TonB-abhängigen Transporter SusC in das Periplasma transportiert werden, wo sie von den Glykosidhydrolasen weiter zu Monosacchariden verarbeitet werden ( GHs) SusAB14. In ähnlicher Weise wurden spezifische PULs für viele andere Glykane beschrieben, wie z. B. Mannan, β-Glucan, Xyloglucan und Galactomannan15,16,17,18,19. Andererseits enthalten grampositive Bakterien Transporter, die Oligosaccharidstrukturen wie Fructooligosaccharide (FOS) durch die vier Komponenten MsmEFGK in Lactobacillus acidophilus20 oder β-Mannane durch ein gelöstes Bindungsprotein (MnBP) und zwei Permeasen (MPP) internalisieren können. in Roseburia intestinalis21. Trotz dieser Fortschritte weisen viele PULs immer noch unbekannte Substratspezifitäten auf, und GH-Familien können mehrere Substrate haben, was es schwierig macht, die Aktivität anhand der Sequenzierung vorherzusagen9,13,22,23,24. Daher sind funktionelle Methoden erforderlich, die Glykane mit ihren Hauptverbrauchern verknüpfen, insbesondere für Firmicutes und andere weniger untersuchte Mitglieder der menschlichen Darmmikrobiota25.

Um diesem Bedarf gerecht zu werden, wurden mehrere Methoden unterschiedlicher Komplexität entwickelt und in hervorragenden Übersichten zusammengefasst, die sich entweder auf die metabolische Membranmarkierung26 oder die metabolische Oligosaccharid-Entwicklung27,28 konzentrieren. Als eine der ersten entwickelten Techniken ist die Stabilisotopensondierung (SIP) eine aufwändige, aber leistungsstarke Methode zur Verfolgung des Stoffwechsels und zur Identifizierung von Verbrauchern, die auf den Stärke- und Galacto-Oligosaccharid-Stoffwechsel in Fermentationssystemen angewendet wurde29,30,31. Allerdings erfordert SIP im Allgemeinen Bakterienwachstum zur Markierung, wodurch bakterielle Medienverzerrungen entstehen. Kürzlich verwendeten Patnode und Kollegen ein vorwärts gerichtetes genetisches Screening, quantitative Metaproteomik und künstliche Nahrungspartikel, um den Faserabbau in Mäusen zu untersuchen, die mit synthetischen Gemeinschaften von Darmbakterien besiedelt waren32. Dieser Ansatz enthüllte den Beitrag von Bacteroides-Arten zur Verarbeitung spezifischer Glykane und verdeutlichte die Konkurrenz zwischen den Arten. In jüngerer Zeit verwendeten dieselben Forscher mit Glykan bedeckte Perlen, um die Adhäsion von Bakterien an Polysaccharide zu untersuchen, und deckten Unterschiede in der Spezifität auf Stammebene auf33. Insbesondere verwendeten sie Magnetkügelchen, um anhaftende Bakterien aus einer bakteriellen Kokultur zu gewinnen und zu identifizieren, und deuteten auf die Möglichkeit hin, diese Methode zur Gewinnung bisher nicht charakterisierter Verbraucher zu verwenden33. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Ansätze in natürlichen, komplexeren Gemeinschaften noch validiert werden müssen.

Physiologische Ansätze der nächsten Generation, die zerstörungsfreie zelluläre Phänotypisierung mit Zelltrennung kombinieren, bieten einen leistungsstarken Rahmen für die Untersuchung der mikrobiellen Physiologie und des Stoffwechsels27. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) in Verbindung mit der Sequenzierung (FACSeq) ist besonders effizient und kann die Physiologie einzelner Zellen innerhalb komplexer Bakteriengemeinschaften aufdecken und so die Identifizierung von Bakterien ermöglichen, die anhand ihres relativen Nukleinsäuregehalts, der Zellmembranintegrität usw. markiert sind Stoffwechsel ohne vorherige Kultivierung34,35,36,37. Die FACSeq-Methode kann in verschiedenen Zusammenhängen angewendet werden, beispielsweise zur Identifizierung von Darmmikrobiota-Taxa, die mit Immunglobulin A oder Cholesterin assoziiert sind38,39. Fluoreszierende Glykane wurden kürzlich verwendet, um die Aufnahme von α-Mannan-Oligosacchariden im Periplasma von B. thetaiotaomicron durch Epifluoreszenzmikroskopie und FACS40 zu demonstrieren, während eine andere Studie die Rolle nicht kultivierter Verrucomicrobia beim Abbau von Polysacchariden in aquatischen Systemen mithilfe von fluoreszierend markierten Glykanen, FACS usw. aufdeckte Einzelzellgenomik41. In jüngerer Zeit verwendeten Doud und Kollegen fluoreszierend markierte Zellulosepartikel, FACS und Amplikonsequenzierung, um Zellulose abbauende Bakterien in geothermischen Quellen aufzudecken42. Insgesamt unterstreichen diese Studien das Potenzial der Kombination kulturunabhängiger Ansätze, um die Bakterienvielfalt mit einem spezifischen Stoffwechsel zu verknüpfen.

Hier verwendeten wir eine metabolische Markierung in Verbindung mit FACS und 16S-rDNA-Amplikonsequenzierung, um die bakterielle Aufnahme von drei strukturell unterschiedlichen Oligosacchariden im Stuhl von drei gesunden, nicht verwandten Freiwilligen aufzudecken. Sortierte Glykan+-Zellen wurden mit Glykan-Sammlern aus dem Stamm der Bacteroidetes, aber auch mit Firmicutes und Actinobakterien wie Blautia wexlerae bzw. Collinsella aerofaciens angereichert. Es wurde bestätigt, dass die Mehrzahl der signifikant markierten Bakterien Glykankonsumenten für das Wachstum sind und GHs mit einer Aktivität kodieren, die mit den verwendeten Glykanen übereinstimmt. Dennoch konnten wir B. wexlerea als bisher nicht gemeldeten FOS-Konsumenten identifizieren. Allerdings zeigten drei mit einem fluoreszierenden Glykan markierte Bacteroidetes-Arten in vitro keinen Wachstumsphänotyp mit diesem Glykan. Parallel dazu isolierten wir bakterielle Glykankonsumenten, die zu drei verschiedenen Phyla gehörten, in einer Probe menschlicher Mikrobiota, indem wir Glykan+-Zellen kultivierten. Diese Methode markiert zwar keine Bakterien, die an der Kreuzfütterung beteiligt sind, ist aber eine nützliche Methode zur Identifizierung von Oligosaccharidkonsumenten.

Um die Aufnahme fluoreszierender Glykane in Darmbakterien zu untersuchen, haben wir zunächst ein Fluorescein-Konjugat von β-Cyclodextrin synthetisiert, das die helikale Struktur von Stärke, einem der häufigsten Polysaccharide in unserer Ernährung, nachahmt und zur strukturellen Charakterisierung von B . thetaiotaomicron SUS43. Das monofunktionalisierte Konjugat (CD-F (1), Abb. 1a) wurde durch präparative HPLC gereinigt und durch Massenspektrometrie (MS) charakterisiert. Die spezifische Aufnahme von CD-F wurde erstmals in Klebsiella oxytoca untersucht, einem Darmbakterium aus dem Stamm der Proteobakterien, das den für Cyclodextrin spezifischen CymA-Transporter enthält44. Der K. oxytoca-Stamm M5A1 wurde in Minimalmedium M9 (MM M9), ergänzt mit 0,1 % β-Cyclodextrin, gezüchtet. Bakterien in der Log-Phase, die mit CD-F inkubiert wurden, zeigten einen signifikanten Fluoreszenzanstieg im Vergleich zu dem der Negativkontrolle (Abb. 1d), der durch Fluoreszenzmikroskopie (Abb. 1e) und Durchflusszytometrie (Abb. S1a) bestätigt wurde.

a–c Synthese fluoreszierender Sonden für β-Cyclodextrin (a), Nystose (b) und Galactosylmannopentaose (c). Monofunktionalisierte Glykane wurden durch Umkehrphasenchromatographie, Größenausschlusschromatographie oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt. Die Produkte wurden massenspektrometrisch charakterisiert. d Fluoreszenz gemessen an gewaschenen Kulturen von K. oxytoca (Proteobacteria) und L. acidophilus (Firmicutes) nach 30-minütiger Inkubation in ihren jeweiligen Minimalmedien mit CD-F- oder NYST-F-Sonde, gemessen mit einem Spektrofluorometer. Die Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). Statistische Signifikanz im Vergleich zur Kontrollbedingung durch ungepaarte t-Tests mit Bonferroni-Dunns Mehrfachvergleichstest. e Konfokalmikroskopisches Bild von fluoreszenzmarkiertem K. oxytoca und 2-Photonen-Mikroskopiebild von L. acidophilus nach Inkubation mit CD-F und NYST-F. Bakterien in der exponentiellen Phase wurden gewaschen und 1 Stunde lang mit den Sonden (500 nM) inkubiert und dann mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. f Fluoreszenzquantifizierung von Bakterien, die aus Stuhlproben nach einstündiger Inkubation mit freiem Fluorescein (4,4 μM) oder CD-F (4,4 μM) mit oder ohne Hitzeschock-Vorbehandlung der Darmmikrobiota für 10 Minuten bei 65 °C isoliert wurden. Die Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). Statistische Signifikanz im Vergleich zur gekennzeichneten Bedingung durch einfache ANOVA mit Bonferronis Mehrfachvergleichstest. Quelldaten und statistische Details werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Anschließend stellten wir fluoreszierend markierte Nystose (NYST-F (2), Abb. 1b) her, ein Tetrasaccharid, das aus Inulin gewonnen wird, einem häufig vorkommenden Fructan-Präbiotikum, das in Weizen, Zwiebeln und Bananen vorkommt (Abb. 1b)45. Eine unselektive Funktionalisierung der Hydroxylgruppen der Nystose wurde durchgeführt, um eine Mischung monofunktionalisierter Nystosen zu erhalten, die an verschiedenen Positionen konjugiert waren. Dies ist wichtig, da wir das mutmaßliche Erkennungsmotiv des Transporters nicht kennen und eine Mischung von Konjugaten die Bindung weniger wahrscheinlich beeinträchtigt. Somit ergab die Reinigung von fluoreszierender Nystose (NYST-F) eine Mischung von Produkten mit identischen Molekulargewichten, die dem monofunktionalisierten Glykan durch massenspektrometrisch gekoppelte Flüssigkeitschromatographie (LC‒MS) entsprachen. Kulturen des bekannten Konsumenten L. acidophilus (Stamm ATCC 4356) wurden in maßgeschneiderter De Man, Rogosa, Sharpe (cMRS)-Brühe gezüchtet, der Glucose entzogen und mit Inulin ergänzt war, und diese Kulturen wurden auch durch Fluoreszenzspektroskopie und Mikroskopie mit NYST-F markiert (Abb. 1d, e)20.

Nachdem wir die Aufnahme fluoreszierender Glykane in kultivierten Isolaten nachgewiesen hatten, markierten wir anschließend Bakterien aus einer Stuhlprobe eines gesunden Freiwilligen metabolisch. Frische Stuhlproben wurden innerhalb von 30 Minuten nach der Entnahme anaeroben Bedingungen ausgesetzt und Aliquots wurden bei –80 °C eingefroren, um sie mit mehreren verschiedenen Glykanen weiter zu testen. Unter diesen Bedingungen blieben die meisten Bakterien nachweislich lebensfähig46. Die Bakterien wurden 1 Stunde lang unter anaeroben Bedingungen mit CD-F inkubiert. Die Fluoreszenzmessung gewaschener Zellen zeigte eine erhöhte Fluoreszenz nach einstündiger Inkubation mit 4,4 μM CD-F (Abb. 1f). Wichtig ist, dass wir bei Verwendung von freiem Fluorescein und wenn die Bakterien vor der Inkubation einem Hitzeschock ausgesetzt wurden, keinen Anstieg der Fluoreszenz beobachteten, was darauf hindeutet, dass das fluoreszierende Glykan einen aktiven Transport durchlief. Höhere Konzentrationen der Fluoreszenzsonde oder eine Verlängerung der Inkubationszeit über 1 Stunde führten nicht zu einem signifikanten Anstieg der Fluoreszenz (Abb. S1b, c). Anschließend wiederholten wir diese Experimente mithilfe der Durchflusszytometrie, um die Zellpopulationen zu quantifizieren, die das fluoreszierende Glykan aufnahmen. Unmarkierte Bakterien wurden als Negativkontrolle verwendet, um den Schwellenwert der fluoreszierenden Bakterienpopulation festzulegen. Die Markierung einer Darmmikrobiotaprobe mit CD-F ergab, dass ca. 1 % der Zellen waren Glykan+, während mit freiem Fluorescein oder nach Hitzeinaktivierung keine Markierung festgestellt wurde (Abb. 2a).

a Repräsentative durchflusszytometrische Pseudofarbdiagramme der Stoffwechselmarkierung. Aus Stuhl isolierte Bakterien wurden mit 4,4 μM CD-F oder Fluorescein mit oder ohne Hitzeinaktivierung 1 Stunde lang inkubiert, gewaschen und mittels Durchflusszytometrie analysiert. b Quantifizierung von Glycan+-Zellen in Stuhlproben, die mit 4,4 µM CD-F-Sonde in Gegenwart steigender Konzentrationen an freiem β-Cyclodextrin inkubiert wurden. Balkendiagramm, das Mittelwerte ± SDs (n = 3) darstellt. Statistische Signifikanz im Vergleich zur CD-F-Bedingung durch einfache ANOVA mit Bonferronis Mehrfachvergleichstest. Spezifität der Kennzeichnung von CD-F (c), NYST-F (d) und GMP-F (e). Aus den Stuhlproben isolierte Bakterien wurden in MM bei 0 °C oder in MM, ergänzt mit 0,1 % Glucose, 1 Stunde lang bei 37 °C vorinkubiert und dann 1 Stunde lang mit CDF-, NYST-F- und GMP-F-Sonden bei 4,4 µM markiert bei 37 °C. Nach dem Waschen wurde der Prozentsatz an Glykan+-Bakterien mittels Durchflusszytometrie gemessen. Die Diagramme stellen die Mittelwerte ± SDs (n = 3) des Prozentsatzes der markierten Bakterien unter verschiedenen Bedingungen dar. Statistische Signifikanz im Vergleich zur CD-F-Bedingung durch einfache ANOVA mit Bonferronis Mehrfachvergleichstest. Quelldaten und statistische Details werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Spezifität der CD-F-Markierung zu demonstrieren, führten wir ein Konkurrenzexperiment mit einer zunehmenden Konzentration an unmarkiertem β-Cyclodextrin (CD) durch. Die durchflusszytometrische Analyse ergab eine allmähliche Verringerung der Markierung, die oberhalb von 436 μM CD signifikant war, was einem 100-fachen Überschuss gegenüber CD-F entspricht (Abb. 2b). Wir versuchten dann zu überprüfen, ob die Markierung auf die Aufnahme von Oligosacchariden zurückzuführen war oder ob das Glykan vor der Aufnahme durch Zelloberflächen- oder sezernierte Glykosidhydrolasen hydrolysiert wurde. Auf diese Weise haben wir das Monosaccharid- (Glucose-F, 4) und Disaccharid- (Maltose-F, 5) Äquivalent der CD-F-Sonde synthetisiert (Abb. S2a). Die durchflusszytometrische Analyse der metabolischen Markierung zeigte im Vergleich zu CD-F eine sehr geringe oder keine Markierung mit Maltose-F und Glucose-F, was bestätigt, dass nur größere Oligosaccharide mit fluoreszierender Markierung aufgenommen wurden (Abb. S2b).

Darüber hinaus bestätigten wir, dass es sich bei der beobachteten Markierung weitgehend um einen aktiven, energieabhängigen Prozess handelte, indem wir die Markierung bei 0 ° C durchführten, wodurch die Markierung sowohl für CD-F als auch für NYST-F unterdrückt wurde (Abb. 2c, d). Die Verwendung komplexer Polysaccharide wird häufig auch durch die Anwesenheit einfacher Monosaccharide wie Glucose unterdrückt47. Daher führten wir die Markierungsexperimente in Medien mit einem Mindestgehalt von 0,1 % Glucose durch. Unter diesen katabolen Repressionsbedingungen wurde die Aufnahme unserer Sonden tatsächlich unterdrückt, was auf einen Zusammenhang zwischen Sondenaufnahme und Metabolismus schließen lässt (Abb. 2c, d).

Ermutigt durch diese Ergebnisse synthetisierten wir ein drittes, strukturell anderes fluoreszierendes Oligosaccharid durch zufällige Funktionalisierung von 63,64-α-D-Galactosyl-β(1,4)-D-mannopentaose, um GMP-F zu erhalten (3, Abb. 1c). Galactomannane sind Hemizelluloseglykane, die in unserer Ernährung vorkommen (z. B. Kaffeebohnen und Tomaten), insbesondere in Form von Verdickungsmitteln wie Guarkernmehl21. Die metabolische Markierung von Bakterienzellen durch GMP-F wurde durch Durchflusszytometrie bestätigt und stand im Gegensatz zu einem Mangel an Sondenaufnahme bei 0 °C und unter katabolen Repressionsbedingungen (Abb. 2e). Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass fluoreszierende Oligosaccharide von Mitgliedern der Darmmikrobiota auf spezifische und energieabhängige Weise aufgenommen werden und weitgehend mit dem bakteriellen Stoffwechsel verknüpft sind.

Anschließend haben wir Stoffwechselmarkierung und FACS mit 16S-rDNA-Amplikonsequenzierung gekoppelt, um Bakterien zu identifizieren, die für die Glykanaufnahme verantwortlich sind. Wir verwendeten unsere drei fluoreszierenden Glykane auf die gleiche Weise bei Stuhlproben von drei nicht verwandten gesunden Personen. Bakterien aus Stuhlaliquoten wurden 1 Stunde lang mit einer Fluoreszenzsonde in Minimalmedium inkubiert, gewaschen und dann für die Durchflusszytometrie aufbereitet. Unmarkierte Kontrollproben wurden verwendet, um den Gating-Schwellenwert für die Sortierung von Glykan+-Zellen festzulegen. Nach Glycan+ sortierte Zellen wurden dann vor der DNA-Extraktion und der Amplifikation der V4-Region des bakteriellen 16S-rRNA-Gens lysiert. Die Illumina MiSeq-Sequenzierung wurde an DNA durchgeführt, die aus 1–3 Millionen sortierten Zellen extrahiert wurde, und an DNA, die zum Vergleich aus den ersten drei Stuhlproben extrahiert wurde. Sequenzlesevorgänge wurden mithilfe der ANCHOR-Pipeline48 verarbeitet und mit Anmerkungen versehen. Kurz gesagt wurden nur Paired-End-Sequenzen, in denen der Primersatz genau nachgewiesen wurde, ausgewählt, ausgerichtet und derepliziert, bevor die exakten Sequenzvarianten (ESVs) ausgewählt wurden. Annotation hat 4 Sequenzrepositorys mit strengen BLASTn-Kriterien abgefragt (>99 % Identität und Abdeckung). Beachten Sie, dass alle Anmerkungen als mutmaßlich gelten und einer Verbesserung unterliegen, sobald Datenbankfehler behoben und neue Arten charakterisiert werden.

Wir haben durchschnittlich 68.122 Lesezählungen pro Probe erhalten, die zwischen 29.360 und 85.124 liegen. Die ANCHOR-Pipeline identifizierte insgesamt 334 verschiedene ESVs. Davon konnten 93 ESVs eindeutig einer Art mit 100 % Abdeckung und >99 % Identität zugeordnet werden, und für 86 der 93 ESVs wurde 100 % Identität erhalten. Die sortierten Glykan+-Proben zeigten niedrigere bakterielle α-Diversitätsindizes (beobachtete ESVs, Chao1 und Shannon) als die Ausgangsstuhlproben, was mit den markierten Zellen übereinstimmt, die eine Untergruppe der anfänglichen Darmmikrobiotaproben darstellen (Abb. S3a). Eine Hauptkomponentenanalyse (PCoA) zeigte eine Häufung der Proben je nach Individuum (Abb. S3b), was darauf hinweist, dass zwischenmenschliche Unterschiede in mikrobiellen Gemeinschaften den größten Teil der Varianz erklären (45 %). Allerdings wurde eine Constrained Ordination (CAP)-Analyse unter Verwendung der markierten Zellen im Vergleich zu den anfänglichen Stuhlproben als A-priori-Hypothese durchgeführt und ergab zwei unterschiedliche Cluster auf einer Ordinationsachse; Dieses Ergebnis erklärte 9 % der Varianz (Abb. S3c) und unterstützte erneut die Anreicherung spezifischer Bakterientaxa aus der ursprünglichen Stuhlprobe. Durch weitere Einschränkung der Analyse nach Glykantyp wurde eine Clusterbildung von NYST-F+-Zellen aus den anderen beiden Sonden beobachtet (Abb. S3d).

Eine DESeq2-Analyse der differenziellen Häufigkeit wurde durchgeführt, um ESVs zu identifizieren, die in den CD-F+-, GAL-F+- oder NYST-F+-Proben im Vergleich zu den ursprünglichen Stuhlproben überrepräsentiert waren, wobei eine Falscherkennungsrate (FDR) von 0,1 als Signifikanzschwelle verwendet wurde49. Trotz der geringen Anzahl an Proben stiegen mehrere ESVs über die Signifikanz hinaus an und waren in den Glykan+-Proben deutlich überrepräsentiert (Abb. 3a). Die metagenomische Shotgun-Sequenzierung einer der Ausgangsstuhlproben wurde dreifach durchgeführt, und für jedes der statistisch signifikanten ESVs wurden passende Sequenzen gefunden, was deren Identität bestätigte (Ergänzungstabelle 2). Da ANCHOR außerdem 16S-Sequenzen beibehielt, konnten die Genome der signifikanten Bakterienarten mit 100 % Abdeckung und Identität für 7/8 der statistisch signifikanten ESVs abgeglichen werden; Daher konnten wir ihre Genome ausführlicher analysieren (Ergänzungstabelle 3).

eine DESeq2-Differentialhäufigkeitsanalyse, die die ESV-Häufigkeit im Ausgangsstuhl mit den Glykan+-Proben vergleicht, ausgedrückt als Vulkandiagramm des angepassten p-Werts als Funktion der log2-fachen Änderung. Die horizontale Linie stellt die statistische Signifikanz dar und wird bei einem FDR von 0,1 gezeichnet. Die Symbole sind entsprechend der Phyla gefärbt und die ESVs, die in den Glykan+-Proben statistisch überrepräsentiert sind, sind gekennzeichnet. b Verteilung der ESVs der Hauptstämme auf der Differentialhäufigkeitsachse. Die statistische Signifikanz verglich die Bacteroidetes und die Firmicutes mit einem zweiseitigen Mann-Whitney-Test. c–f DESeq2-Differenzialhäufigkeitsbalkendiagramme für die Ordnung Bacteroidales (c), Prevotella copri (d), Blautia wexlerae_1 (e) und Collinsella aerofaciens (f). Balkendiagramme stellen die durch DESeq2 ermittelte log2-fache Änderung ± log2-fache Änderung des Standardfehlers dar. Quelldaten und statistische Details werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

ESVs, die zum Stamm Bacteroidetes gehören, waren in Glycan+-Proben im Vergleich zu Firmicutes überrepräsentiert (Abb. 3b). Darüber hinaus war die Ordnung Bacteroidales in den mit Glycan+ markierten Proben für alle Glykane deutlich überrepräsentiert, was auf die allgemeine Fähigkeit ihrer Mitglieder hinweist, Glykane zu metabolisieren (Abb. 3c)8.

Insgesamt fanden wir neun auf Artenebene identifizierte ESVs, die in den Glycan+-Proben überrepräsentiert waren (Abb. 3a). Davon waren vier aufgrund ihrer früheren Stoffwechselfähigkeit bekannt. Es wurde festgestellt, dass Prevotella copri (Bacteroidetes) in allen drei Glycan+-Proben überrepräsentiert ist (Abb. 3d), was das umfangreiche Repertoire an Polysaccharid-Nutzungsgenen und die bekannte Fähigkeit, auf Stärke, Inulin und Galactomannan zu wachsen, unterstützt50,51. Darüber hinaus beobachteten wir, dass Parabacteroides distasonis durch Cyclodextrin markiert wurde (Abb. 3a). Unsere 16S-Sequenz stimmte mit 100 % Homologie und Abdeckung für den Stamm P. distasonis CL03T12C09 überein, der in seinem CAZyme-Repertoire 6 Glycosidhydrolasen der Familie 13 (GH13, α-Amylase) enthält, die mit dem Stärkestoffwechsel konsistent sind.

Die folgenden ESVs waren in den NYST+-Proben überrepräsentiert und waren keine bekannten FOS-Konsumenten: Blautia wexlerae (Firmicutes) und Collinsella aerofaciens (Actinobacteria) (Abb. 3a, e, f). Darüber hinaus waren die folgenden Bacteroidales, die in den GMP+-Proben überrepräsentiert waren, keine bekannten Galactomannan-Konsumenten: Alistipes communis, Bacteroides vulgatus und Bacteroides caccae (Abb. 3a). Wir haben diese Wechselwirkungen daher genauer untersucht, um festzustellen, ob diese Glykane in vitro zum Wachstum dieser Isolate führen.

Es wurde gezeigt, dass B. wexlerae in einer FOS-Supplementierungsstudie an Schweinen52 und in der Ex-vivo-Fermentation menschlicher Mikrobiota53 erhöht ist, über seinen Glykanstoffwechsel ist jedoch wenig bekannt, und diese Art ist nicht in der CAZy-Datenbank24 enthalten. Da die genetische Grundlage des FOS-Metabolismus in L. acidophilus einen MsmEFGK-ABC-Transporter und einen GH3254 umfasst, suchten wir nach diesem homologen PUL im B. wexlerae-Stamm BIOML-A12, der mit unserer Sequenz mit 100 % Identität und Abdeckung übereinstimmte. Wir fanden ein ähnliches System in B. wexlerae, das GH32- und MsmEFG-Transportergene enthielt und somit die FOS-Aufnahme und den FOS-Metabolismus unterstützte (Abb. 4e, S4a). Anschließend erhielten wir B. wexlerae (DSM 19850, 100 % Identität und Abdeckung mit unserem ESV) und bewerteten seine Fähigkeit, auf verschiedenen Kohlenhydraten zu wachsen. Während der Stamm in Medien mit minimalem Kohlenhydratmangel ein minimales Wachstum zeigte, zeigte er ein robustes Wachstum, wenn dem Medium Fruktose, FOS oder Inulin zugesetzt wurde (Abb. 4a). Darüber hinaus wurde bei Levan, einem verwandten β-2,6-Fructo-Oligosaccharid, nur langsames Wachstum beobachtet. Darüber hinaus wurde B. wexlerae in Kultur durch NYST-F robust markiert (Abb. 4b). Daher ist B. wexlerae ein FOS-Konsument und enthält mutmaßliche Gene, die mit dem FOS-Metabolismus für das Wachstum übereinstimmen.

Wachstum von B. wexlerae (a) und C. aerofaciens (c) in MM, ergänzt mit verschiedenen Fructooligosacchariden, für 48 Stunden. Die Lebensfähigkeit der Bakterien wurde durch Wachstum in MM, ergänzt mit Fruktose, bewertet. Bei allen Wachstumsmessungen handelt es sich um Mittelwerte von Dreifachmessungen. Exponentielle Kulturen von B. wexlerae (n = 5) (b) und C. aerofaciens (n ​​= 3) (d) in MM, ergänzt mit FOS, wurden 1 Stunde lang mit NYST-F inkubiert. Der Prozentsatz der NYST+-Bakterien wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Daten aus drei bis fünf unabhängigen Experimenten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. Statistische Signifikanz im Vergleich zur GMP-F-Bedingung durch einfache ANOVA mit Bonferronis Mehrfachvergleichstest. Karte potenzieller FOS-Metabolismus-assoziierter Gene. Identifizierung mutmaßlicher Gene, die am Metabolismus von FOS in B. wexlerae (e) und C. aerofaciens (f) beteiligt sind. BLAST-Alignments wurden am gesamten in der NCBI-Datenbank verfügbaren Genom mit den bekannten Glykosidhydrolasen durchgeführt, die am GMP- und FOS-Metabolismus beteiligt sind. Quelldaten und statistische Details werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Anschließend untersuchten wir C. aerofaciens, von dem berichtet wurde, dass er auf Levan, nicht jedoch auf FOS55, einen schwachen Wachstumsphänotyp aufweist. In der CAZy-Datenbank sind drei GH32 im Genom von C. aerofaciens ATCC 25986 annotiert (100 % Identität und Abdeckung zu unserem ESV). Der erste PUL umfasst zwei GH32-Gene, die ein IIC-Gen der Untereinheit des Phosphoenolpyruvat:Zucker-Phosphotransferase-Systems (PTS) flankieren. Der zweite Locus enthält ein GH32- und ein PTS-Untereinheit-IIB-Gen. Diese beiden Loci sind homolog zu bekannten PULs, die am FOS-Metabolismus im eng verwandten Anaerostipes hadrus beteiligt sind, was darauf hindeutet, dass sie am Fructose-Polymer-Metabolismus beteiligt sind (Abb. 4f, S4b)56. Wir erhielten C. aerofaciens ATCC 25986 und bestätigten, dass es in Minimalmedien, die Hefe und Rindfleischextrakt, ergänzt mit Levan, aber nicht FOS oder Inulin, enthielten, langsam wachsen konnte (Abb. 4c). Dennoch wurden isolierte Kulturen von C. aerofaciens mit NYST-F markiert (Abb. 4d). Dieses Ergebnis zeigt, dass C. aerofaciens zwar Oligofructose verbraucht, diese jedoch spezifisch für die β-2,6-Bindungen in Levan ist, im Gegensatz zur β-2,1-Bindung in FOS und Inulin.

B. vulgatus und B. caccae wurden ebenfalls signifikant durch GMP-F markiert (Abb. 3a), obwohl in den Genomen sequenzierter Isolate in der CAZy-Datenbank24 GH26 fehlte. Darüber hinaus ist bekannt, dass B. caccae auf diesem Substrat nicht wächst55. Wir kultivierten daher B. vulgatus (ATCC 8482) und B. caccae CLD22004 (das aus einer der Stuhlproben isoliert wurde, siehe unten) und bestätigten das fehlende Wachstum in Minimalmedien (MM) mit 0,1 % GMP als einziger Kohlenstoffquelle , wohingegen bei mit Glucose ergänztem MM ein Wachstum beobachtet wurde (Abb. S5). Wir haben weiterhin bestätigt, dass beide Stämme nach dem Wachstum in BHI durch GMP-F markiert wurden, wie durch Durchflusszytometrie zu sehen war (2,18 % bzw. 1,25 % der Glycan+-Zellen für B. vulgatus bzw. B. caccae), was durch Hitzeschock aufgehoben wurde ( Abb. S5). Diese Daten deuten darauf hin, dass eine gewisse Aufnahme von fluoreszierendem Glykan stattgefunden hat, jedoch wahrscheinlich durch einen PUL mit einem verwandten Substrat, oder dass der Stoffwechsel nicht ausreichte, um das Wachstum dieser Isolate aufrechtzuerhalten.

In ähnlicher Weise wurde Alistipes communis (alias Alistipes obesi)57 durch Galactomannopentaose markiert (Abb. 3a). Über den Galactomannan-Metabolismus in A. communis ist wenig bekannt, es ist jedoch bekannt, dass dieses Bakterium α-Galactosidase-Aktivität aufweist58. Der Stamm A. communis 5CBH24 (100 % Identität und Abdeckung mit unserem ESV) kodiert einen klassischen SusC/D-ähnlichen PUL mit 2 GH26s (mit β1-4-Mannanase-Aktivität), einem GH130 (einer Mannosylphosphorylase) und einem GH97 (α-Galactosidase-Aktivität), was mit dem Galactomannan-Metabolismus übereinstimmt (Abb. S5j) und dem bekannten Galactomannan-PUL in B. ovatus ähnelt18. Während A. communis 5CBH24 in kohlenhydratarmen Columbia-Medien langsam wachsen konnte, wurde sein Wachstum durch die Zugabe von Glucose, nicht aber von Galactomannan gesteigert (Abb. S5g), was darauf hindeutet, dass dieser Stamm nicht in der Lage ist, dieses Substrat für das Wachstum zu nutzen.

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass 66 % (6/9) der in den Glycan+-Proben deutlich überexprimierten ESVs bekannte oder bestätigte Konsumenten des Glykans waren, dass 33 % (3/9) die Glykane jedoch nicht für das Wachstum in vitro verwenden konnten .

In Anbetracht der Tatsache, dass die sortierten markierten Zellen reich an Glykankonsumenten waren, verwendeten wir diese Untergruppe von Zellen weiter, um spezifische Glykankonsumenten aus menschlichen Stuhlproben zu isolieren. Dadurch erhielten wir Zugang zu den in der Probe vorhandenen Bakterienstämmen und konnten deren Wachstumsphänotyp direkt untersuchen. Zunächst wurden fäkale Bakterien 1 Stunde lang mit GMP-F markiert und Glykan+-Zellen 5 Minuten lang sortiert (wodurch etwa 27.000 sortierte Zellen erreicht wurden), bevor sie sofort unter anaeroben Bedingungen in reduziertem PBS resuspendiert wurden. Anschließend wurden verdünnte Bakterien 72 Stunden lang auf BHI kultiviert. Aus dieser Kultur wurde ein GMP-Verbraucher (Stamm CLD22001) isoliert, was durch seine Fähigkeit gezeigt wurde, in MM mit 0,1 % GMP als einziger Kohlenstoffquelle, aber nicht in MM allein zu wachsen (Abb. 5a). Anschließend führten wir eine DNA-Extraktion und Amplifikation der gesamten 16-S-rDNA-Region durch, gefolgt von einer Sanger-Sequenzierung. Durch BLAST-Alignment der V1V9-Sequenz mit der NCBI-Nukleotiddatenbanksammlung wurde der Stamm CLD22001 als Bacteroides xylanisolvens mit 99,79 % Identität und 100 % Abdeckung mit B. xylanisolvens (Stamm funn3) identifiziert. Mehrere Mitglieder der B. xylanisolvens beherbergen den Galactomannan-PUL, der in B. ovatus charakterisiert wurde, wodurch sie auf Galactomannan wachsen können18,19. Durch Durchflusszytometrie haben wir bestätigt, dass B. xylanisolvens CLD22001-Zellen mit GMP-F markiert wurden, wenn sie auf MM mit GMP gezüchtet wurden (Abb. 5a). Auf die gleiche Weise haben wir den B. caccae-Stamm CLD22004 isoliert, der eine 100-prozentige Abdeckung und 98,95-prozentige Identität mit dem Stamm CL03T12C61 aufweist. Wir haben gezeigt, dass dieser Stamm mit GMP-F markiert war, aber nicht auf GMP wachsen konnte (Abb. S5a – c).

a Wachstum von B. xylanisolvens CLD22001 in Minimalmedium, ergänzt oder nicht mit 0,1 % Galactomannopentaose. Die Wachstumskurven sind der Mittelwert und der Standardfehler von drei unabhängigen Replikaten. GMP-F-Aufnahme durch B. xylanisolvens CLD22001. Die exponentiellen Kulturen von B. xylanisolvens CLD22001 in MM, ergänzt mit GMP, wurden 1 Stunde lang mit GMP-F inkubiert. Der Prozentsatz der GMP+-Bakterien wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Daten aus drei unabhängigen Experimenten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. Statistische Signifikanz im Vergleich zur GMP-F-Bedingung durch einfache ANOVA mit Bonferronis Mehrfachvergleichstest. Wachstum von B. uniformis CLD22005 (b), B. angulatum CLD22003 (c) und E. coli CLD22006 (d) auf MM, das mit 0,1 % FOS ergänzt ist oder nicht. Quantifizierung der NYST-F-Aufnahme durch B. uniformis CLD22005 (b), B. angulatum CLD22003 (c) und E. coli CLD22006 (d) mittels Durchflusszytometrie, mit oder ohne Hitzeschock vor der Markierung. Alle Messungen wurden dreifach durchgeführt und der Mittelwert ± SD wird angezeigt. Statistische Signifikanz im Vergleich zur Sondenbedingung durch einfache ANOVA mit Bonferronis Mehrfachvergleichstest. Quelldaten und statistische Details werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Anschließend kultivierten wir nach NYST-F+ sortierte Zellen, um FOS-Konsumenten zu isolieren. Hier wurden die sortierten markierten Bakterien sofort in reduziertem ABB-Medium, ergänzt mit 0,1 % FOS, unter anaeroben Bedingungen resuspendiert. Nach 48-stündiger Inkubation wurden die kultivierten Bakterien in einer Verdünnung von 1/100 in MM, ergänzt mit 0,1 % FOS als einziger Kohlenstoffquelle, überführt und 48 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen inkubiert. Die FOS-Konsumenten wurden dann 72 Stunden lang auf ABB oder TSA, ergänzt mit 5 % Schafsblut, isoliert und dann wie oben beschrieben charakterisiert. Wir haben einen Bacteroides uniformis (Stamm CLD22005, mit 100 % Abdeckung und Identität mit dem Stamm CL11T00C07) isoliert, der in MM mit FOS, aber nicht in MM allein wachsen konnte (Abb. 5b). Die Markierung kultivierter Isolate war gering, wurde jedoch durch Hitzeschock aufgehoben (Abb. 5b). B. uniformis (CL11T00C07) enthält einen vorhergesagten PUL 32 mit 4 GH32; ein GH172; und eine Kohlenhydratbindungsmodulfamilie 38 (CBM38), die für die Inulinbindung bekannt ist, zusammen mit dem SusCD-Transporter, und diese Ergebnisse stimmen mit dem FOS-Verbrauch überein. Daher ist bekannt, dass B. uniformis auf Fruktose und Inulin wächst59. Darüber hinaus wurde der Stamm CLD22003, der auf mit FOS ergänztem MM wuchs, als Bifidobacterium angulatum (Actinobacteria) mit 100 % Abdeckung und 99,79 % Identität mit mehreren Stämmen, einschließlich DMS 20098, identifiziert. Der FOS-Metabolismus von B. angulatum wurde durch Wachstum auf mit FOS ergänztem MM bestätigt FOS als einzige Kohlenhydratquelle und eine starke Aufnahme der NYST-F-Sonde, gemessen durch Zytometrie (Abb. 5c). Die Gattung Bifidobacterium ist in Studien mit durch FOS-Supplementierung angereicherten Diäten für den FOS-Metabolismus bekannt, und B. angulatum ist in vitro ein bekannter Verbraucher60,61. Schließlich erhielten wir einige Proteobakterien, darunter den Stamm CLD22006 mit einem 16-S-Gen, der mit mehreren Escherichia coli-Stämmen mit 100 % Abdeckung und Identität übereinstimmt, einschließlich der Stämme TUM13867. Der E. coli-Stamm konnte in MM mit FOS wachsen und die NYST-F-Markierung war robust (Abb. 5d). Es wurde berichtet, dass Enterobakterien wie E. coli FOS62 metabolisieren.

Diese Ergebnisse zeigen, dass funktionelle Sortierung und Kultivierung zur Isolierung und Identifizierung von Glykankonsumenten aus Stuhlproben führen können. Während wir hier drei verschiedene Glykanstrukturen im Detail untersucht haben, ist die Methode auch auf andere Strukturen anwendbar. Tatsächlich haben wir unser Glykan-Repertoire durch die Herstellung von fünf zusätzlichen Fluorescein-konjugierten Oligosacchariden auf Basis von Xylan, Mannan, Arabinoxylan, Arabinan und FOS erweitert (Abb. S6a) und durch Durchflusszytometrie bestätigt, dass diese zusätzlichen Glykane von Bakterien in einer Stuhlprobe aufgenommen wurden (Abb. S6b).

Da wir über ein deskriptives Verständnis der menschlichen Darmmikrobiota hinausgehen, sind funktionelle Tests erforderlich, um die Rolle spezifischer Bakterien innerhalb der Gemeinschaft und in Bezug auf den Wirt zu untersuchen25. Aus der Nahrung gewonnene komplexe Glykane sind ein wichtiger Faktor für die Diversität und den Stoffwechsel von Darmmikroben, aber wir haben immer noch ein unvollständiges Verständnis des spezifischen Glykanstoffwechsels im Darm. Dieses Wissen ist jedoch von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Mechanismen präbiotischer Anwendungen, bei denen für Mikrobiota zugängliche Glykane verwendet werden, um die mikrobielle Zusammensetzung und den Stoffwechsel im Darm zu manipulieren63,64,65,66. Die Identifizierung von Darmbakterien, die präbiotische Glykane verbrauchen, ist ein wichtiger Schritt, um letztendlich bakterielle Faktoren oder Metaboliten aufzudecken, die gesundheitliche Vorteile für den Wirt vermitteln67.

Hier verwendeten wir einen funktionellen Assay, der aktive metabolische Markierung mit FACSeq oder Culturomik kombinierte, um Aufschluss über die Glykanaufnahme in Proben menschlicher Darmmikrobiota zu geben, ohne vorher die beteiligten metabolischen Gene zu kennen. Eine metabolische Markierung von Bakterien durch fluoreszierende Glykane ist möglich, da Oligosaccharide in Bakterien aufgenommen werden, wodurch eine kleine fluoreszierende Markierung unbemerkt bleibt15,40. Tatsächlich hydrolysiert das prototypische SUS Polysaccharide an der Zelloberfläche zu Oligosacchariden, die innerhalb der Zelle für den weiteren Stoffwechsel aufgenommen werden. Diese Aufnahme verhindert, dass andere Bakterien von Stoffwechselnebenprodukten profitieren. Unsere Experimente zeigten, dass die Glucose-Monosaccharid-Sonde im Gegensatz zu größeren Oligosacchariden, die in Bakterienzellen transportiert wurden, nicht aufgenommen wurde. Dies deutet darauf hin, dass der Fluorescein-Tag den Transport kleiner Monosaccharide stört, nicht jedoch größerer Oligosaccharide. Es ist jedoch auch möglich, dass es vor der intrazellulären Aufnahme zu einer Ringöffnung oder teilweisen Hydrolyse von Cyclodextrin kommt. Wir minimierten die möglichen schädlichen Auswirkungen der Farbstoffkonjugation durch zufällige Funktionalisierung an verschiedenen Positionen und erhöhten so die Wahrscheinlichkeit, dass das Glykan-Erkennungsmotiv der Kohlenhydrat-bindenden Domäne oder des Transporters nicht durch das Fluorophor maskiert wurde. Im Gegensatz zur egoistischen Polysaccharidverwertung hydrolysieren einige Darmbakterien Polysaccharide an der Zelloberfläche und setzen dabei Monosaccharide frei, die von anderen Arten leicht verwertet werden68. Unser Ansatz erkennt nur die Oligosaccharidaufnahme und identifiziert keine bakterielle Kreuzfütterung oder nachgeschalteten Sekundärstoffwechsel, die noch bestimmt werden müssen. Darüber hinaus ist es möglich, dass ein Oligosaccharid von einem Bakterium teilweise hydrolysiert und von einem anderen aufgenommen wird68,69.

Diese Machbarkeitsstudie wurde mit drei verschiedenen Glykanen an Proben von drei unabhängigen gesunden Freiwilligen durchgeführt. Die differenzielle Häufigkeitsanalyse verdeutlichte die Aufnahmefähigkeit mehrerer Bakterien, und von einigen dieser Bakterien war bereits bekannt, dass sie Stärke, Galactomannan und FOS verbrauchen. Unsere Arbeit hat deutlich die generalistische Fähigkeit der Bacteroidales-Ordnung hervorgehoben, die mit ihrem bekannten großen CAZyme-Repertoire übereinstimmt, während die Glykanaufnahme bei den Firmicutes spärlicher verteilt und auf nur eines der getesteten Glykane beschränkt war, was wiederum mit der Tatsache übereinstimmt, dass sie über eine verfügen kleineres Repertoire an CAZymes als Bacteroidetes8.

Wichtig ist, dass diese Pipeline es uns ermöglichte, Firmicutes B. wexlerae als Verbraucher von FOS und Inulin zu identifizieren. Dieser Metabolismus wird wahrscheinlich durch einen PUL vermittelt, der einen GH32- und einen ABC-Transporter mit Homologie zum FOS-PUL von L. acidophilus enthält (Abb. S4b). Die Ausweitung des Screenings auf verschiedene Glykane und verschiedene Proben wird wahrscheinlich zu weiteren bisher unbekannten Verbrauchern führen. Wir haben bereits die Synthese von fünf zusätzlichen Sonden und deren Markierung von Darmbakterien in einer Stuhlprobe demonstriert (Abb. S6), was die Machbarkeit unseres Ansatzes unterstreicht.

Die hier beobachtete Markierung wurde bei 0 °C oder in Gegenwart von Glucose weitgehend aufgehoben, was auf einen aktiven Prozess im Zusammenhang mit dem Stoffwechsel schließen lässt. Allerdings fehlte drei mit GMP-F markierten Bakterien (A. communis, B. vulgatus und B. caccae) die Fähigkeit, in vitro auf Galactomannan zu wachsen. Während GMP-F in diesem Fall ohne Aufnahme an Oberflächenproteine ​​binden kann, unterstützt der Verlust des Fluoreszenzsignals bei Inaktivierung durch Temperatur die aktive Aufnahme von Glykanen. Es ist möglich, dass das Glykan aktiviert wird und an einen aktiven PUL auf einem strukturell verwandten Glykan gebunden oder von diesem aufgenommen wird und dass die GH-Spezifität einen effizienten Stoffwechsel ausschließt. Tatsächlich wurde C. aerofaciens durch Nystose markiert, die β-2,1-Fructose-Bindungen enthielt, konnte aber auf diesem Substrat nicht wachsen und verstoffwechselte stattdessen Levan, das β-2,6-Fructose-Bindungen enthielt, für das Wachstum. Darüber hinaus beherbergt A. communis einen PUL mit starker Ähnlichkeit zum bekannten Galactomannan-PUL von B. ovatus, was auf eine Aktivität auf einem α-Galactose- und β-Mannose-haltigen Substrat schließen lässt, auch wenn kein Wachstum auf Galactomannan beobachtet wurde18. Das Fehlen von Wachstum bei Bakterienstämmen, die den entsprechenden PUL in ihrem Genom codieren, wurde für Arabinogalactan in P. copri beobachtet und kann auf geringfügige Unterschiede im Substrat oder eine ungenaue Spezifität basierend auf der Genannotation zurückzuführen sein50. Alternativ können Glykane von Proteinen erkannt werden, die an Quorum-Sensing-Signalwegen oder Host-Sensing-Signalwegen beteiligt sind, wie dies für Fucose in Krankheitserregern vorgeschlagen wurde70,71. Daher reicht die metabolische Markierung allein, selbst bei Genen, die mit einer Aktivität übereinstimmen, nicht aus, um auf den Stoffwechsel für das Wachstum zu schließen, und es sind weitere Studien erforderlich, um die möglichen beteiligten Stoffwechselwege und ihre Funktion für die Bakterienzelle vollständig zu charakterisieren.

Wir haben daher unseren Ansatz erweitert, um Bakterienkulturen nach der Sortierung von Glykan+-Zellen einzubeziehen, um Verbraucher in der untersuchten Stuhlprobe zu isolieren. Dadurch konnten wir das Wachstum direkt in vitro mithilfe der in den Proben vorhandenen Bakterienstämme validieren und das Problem vermeiden, auf einen Stamm basierend auf einem Teil des 16S-rRNA-Gens zu schließen. In einer Machbarkeitsstudie haben wir vier Klone aus drei verschiedenen Phyla isoliert, die GMP und FOS als einzige Kohlenstoffquelle in der Kultur verbrauchen könnten. Die Klone wurden durch Sanger-Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens als B. xylanisolvens (Bacteroidetes) identifiziert, die auf GMP wachsen, und als B. angulatum (Actinobacteria), B. uniformis (Bacteroidetes) und E. coli (Proteobacteria), die auf FOS wachsen. Während diese Konsumenten bekannt waren, könnten umfangreichere Kulturstudien mit unterschiedlichen und spezifischeren Wachstumsmedien zu unbekannten Konsumenten führen72. Darüber hinaus ist die aerobe Umgebung des Sortierschritts wahrscheinlich schädlich für viele streng anaerobe Bakterien, und die Sortierung unter anoxischen Bedingungen wird höchstwahrscheinlich die Gewinnung lebender Bakterien, die durch fluoreszierende Glykane markiert sind, verbessern.

Bestehende Ansätze zur Untersuchung des bakteriellen Glykanstoffwechsels konzentrieren sich typischerweise auf vereinfachte komplexe Gemeinschaften, die trotz beispielloser Erkenntnisse schwer zu reproduzieren sein können32,33. Unser Ansatz ergänzt solche Studien durch die Verwendung ganzer menschlicher Stuhlproben, die auch vom Patienten stammen könnten, um verschiedene Bakterientaxa zu erfassen. Da unsere Pipeline funktionsfähig ist und einen Zellsortierungsschritt umfasst, werden tote oder beschädigte Zellen in den Originalproben nicht gekennzeichnet, selbst wenn sie die entsprechende Stoffwechselmaschinerie kodieren. Somit ist unsere Methode eine Ergänzung zu genomischen Methoden, die nicht zwischen aktiven, inaktiven, lebenden oder beschädigten Zellen unterscheiden34. Die Ausweitung dieses Ansatzes auf andere Glykane und Proben kann dazu beitragen, die PUL-Spezifität weiter zu kommentieren und Stoffwechselgene und -wege zu entdecken.

Aufgrund ihrer nichtinvasiven Natur ist die Probenahme von menschlichem Stuhl ein leistungsstarker Ersatz für die Darmmikrobiota, da Bakterien metabolisch aktiv bleiben können, wenn sie schnell anoxischen Bedingungen ausgesetzt werden35,73,74. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass Stuhlproben keine Informationen über den Standort spezifischer Darmbakterien entlang des Verdauungstrakts oder in der Tiefe der Schleimschicht liefern und dass ihre Zusammensetzung ausgeschiedene Bakterien darstellt75. Darüber hinaus variiert die Zusammensetzung der Stuhlproben je nach Stuhlkonsistenz, was Unterschiede in der Transitzeit und möglicherweise unterschiedliche Nischenproben widerspiegelt76. Dennoch sollte diese Pipeline auch auf andere Arten von Darmmikrobiota anwendbar sein, beispielsweise auf Koloskopiebiopsien.

Hier haben wir die Verwendung einer funktionellen Pipeline beschrieben, die Bakterien identifiziert, die bestimmte Glykane in komplexen Darmmikrobiota-Proben aufnehmen, und so unser funktionelles Verständnis des Glykanstoffwechsels in der menschlichen Darmmikrobiota erweitert. Die Anwendung dieser Pipeline auf andere Glykanstrukturen und auf andere menschliche Populationen mit unterschiedlicher Ernährung sowie auf Personen mit Magen-Darm-Erkrankungen könnte dabei helfen, mutmaßliche Konsumenten von Nahrungsglykanen und präbiotischen Strukturen zu identifizieren. Darüber hinaus ist die Kombination dieser Methode mit der Kulturomik nützlich, um bakterielle Konsumenten zu isolieren, ohne die spezifischen beteiligten Gene zu kennen, was möglicherweise zur Entdeckung neuer CAZymes führt. Die Methode könnte auch mit anderen Genomanalysen wie Metagenomik und Einzelzellgenomik gekoppelt werden, um den Glykanstoffwechsel in Nicht-Bacteroidetes-Bakterien zu charakterisieren und zwischen Stoffwechsel für Wachstum und Stoffwechsel ohne Wachstum zu unterscheiden.

Lactobacillus acidophilus (Moro) Hansen und Mocquot (ATCC® 4356™) (La) und Klebsiella oxytoca M5A1 (Ko), die von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erworben wurden, wurden bei 37 °C in De Man kultiviert. Rogosa-, Sharpe-(MRS)-Medium bzw. Luria-Bertani-(LB)-Medium.

Die detaillierte Synthese der Fluorescein-konjugierten Glykane finden Sie in den Begleitinformationen zusammen mit den HPLC-Chromatogrammen.

Das Protokoll A04-M27-15B wurde vom Institutional Review Board der McGill Faculty of Medicine genehmigt. Wir haben von den Teilnehmern eine schriftliche Einverständniserklärung zur Verwendung menschlicher Proben erhalten. Teilnahmeberechtigt waren gesunde Teilnehmer mit einem Body-Mass-Index zwischen 18,5 und 30, ohne diagnostizierte Magen-Darm-Erkrankung, ohne laufende therapeutische Behandlung und ohne Antibiotikaeinnahme 3 Monate vor Studienbeginn. Die Probandeninformationen wurden zum Zeitpunkt der Probenahme aufgezeichnet. Das Alter der Spender lag zwischen 21 und 40 Jahren. Die ersten Experimente wurden an einer Probe eines männlichen Spenders durchgeführt. Die metabolische Markierungs-FACSeq-Pipeline wurde an Proben von einer Frau und zwei Männern im Alter von 30–40 Jahren durchgeführt, und der BMI lag zwischen 19 und 27 kg/m2. Frische Stuhlproben wurden gesammelt und sofort in eine anaerobe Kammer gegeben, aliquotiert und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Kulturen im Minimalmedium M9 (MM M9) von Ko, ergänzt mit 0,1 % β-Cyclodextrin, wurden während des exponentiellen Wachstums durch Zentrifugation gesammelt, in MM M9 gewaschen und in 195 µL MM M9 suspendiert. Ko wurden mit 500 nM CD-F-Sonden oder einem gleichen Volumen MM M9-Zellen als Kontrolle behandelt. Die Zellen wurden unter Schütteln 30 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Die Zellen wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 15.000 × g gesammelt und zweimal mit 1 ml MM M9 gewaschen. Die Pellets wurden in 200 μl MM M9 resuspendiert und die Fluoreszenz wurde mit einem Spark 10 M Tecan-Plattenlesegerät bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm nach der Emission bei 535 nm gemessen. Fluoreszenzmessungen wurden dreifach durchgeführt und die Mittelwerte und Standardabweichungen sind in den Abbildungen dargestellt.

Kulturen in kundenspezifischem MRS (cMRS) (Pepton (10 g/L), Hefeextrakt (5 g/L), Natriumacetat (5 g/L), Ammoniumcitrat (92 g/L), Kaliumphosphat (2 g/L). ), Magnesiumsulfat (0,2 g/L), Mangansulfat (0,05 g/L), Tween 80 (1 ml\L)) von La, ergänzt mit 0,1 % Inulin, wurden während des exponentiellen Phasenwachstums durch Zentrifugation gesammelt, in cMRS gewaschen und suspendiert in 195 µL cMRS. La wurden mit 500 nM NYST-F-Sonden oder einem gleichen Volumen cMRS als Kontrolle behandelt. Die Zellen wurden unter Schütteln 30 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Die Zellen wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 15.000 × g gesammelt und zweimal mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Pellets wurden in 200 μl PBS resuspendiert und die Fluoreszenz wurde mit einem Spark 10 M Tecan-Plattenlesegerät bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm nach der Emission bei 535 nm gemessen. Fluoreszenzmessungen wurden dreifach durchgeführt und die Mittelwerte und Standardabweichungen sind in den Abbildungen dargestellt.

Nach der Kohlenhydratmarkierung wurden Ko oder La 30 Minuten lang mit einer Lösung von 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit einer PBS-Lösung gewaschen und in gleichen Volumina mit ProLong Gold Antifade-Reagenz (Invitrogen) gemischt. Fixierte Bakterien wurden auf einem Objektträger und einem Deckglas angebracht, und die Bilder wurden mit einem konfokalen LEICA SP8-Mikroskop (für Ko) und einem Leica DM100-Mikroskop (für La) aufgenommen und mit der Leica LAS X-Software verarbeitet.

Die Durchflusszytometrieanalyse wurde mit einem 5-Laser-LSR-Fortessa-20-Parameter-Analysegerät durchgeführt. Die Zellsortierung wurde mit drei Lasern, einem FACSAria-III-Laser mit 13 Detektoren oder vier Lasern und einem FACSAria Fusion mit 18 Detektoren durchgeführt. Die Daten wurden mit der Software BD FACSDiva oder FlowJo analysiert. Um die Schwellenwerte für den spezifischen Nachweis der durch die Fluoreszenzsonden markierten Zellen festzulegen, verwendeten wir unmarkierte Zellen als Negativkontrollen. Die Erkennungsschwelle für Signale im FITC-Kanal wurde auf 103 eingestellt, verglichen mit dem maximalen Signal, das von der Negativkontrolle bei 3 × 102 erzeugt wurde. Die Gating-Schwelle kann auf verschiedene Ebenen eingestellt werden, um die Empfindlichkeit des Assays abhängig von den Sonden anzupassen. Fünfzigtausend oder 100.000 Ereignisse pro Probe wurden analysiert und die FITC-Fluoreszenz wurde mithilfe des FITC-Kanals mit Anregung bei 488 nm und Emission bei 535 nm gemessen. Um Dubletts auszuschließen, wurde ein FSC- und SSC-Gating (Vorwärts- bzw. Seitenstreuung) durchgeführt. Insgesamt wurden 1 bis 3 × 106 Zellen für jede Probe sortiert.

Alle Markierungsexperimente wurden unter anaeroben Bedingungen (87 % N2, 10 % CO2 und 3 % H2) durchgeführt. Eine 0,1 g Stuhlprobe wurde abgewogen und auf 1:10 g/ml in Minimalmedium (MM) verdünnt (6,6 mM KH2PO4 (pH 7,2), 15 mM NaCl, 100 μM MgCl2, 175 μM CaCl2, 50 μM MnSO4, 5 mM ( NH4)2SO4, 15 μM FeSO4, 24 μM NaHCO3, 1 g/L-1 L-Cystein, 1,9 μM Hämatin, 6 μM Hämin und 200 ng/ml-1 Vitamin B12), gründlich gevortext und 3 Minuten lang bei 700 zentrifugiert × g. Der Überstand wurde aufbewahrt und das Pellet verworfen. Der Überstand wurde 5 Minuten lang bei 6500 × g zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet mit MM gewaschen. Das Pellet wurde in 200 µL MM resuspendiert. Kohlenhydratsonden wurden in einer Endkonzentration von 4,4 µM hinzugefügt. Die Inkubation erfolgte unter Lichtschutz eine Stunde lang bei 37 °C. Anschließend wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 6500 × g zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet zweimal mit reduziertem PBS (rPBS) gewaschen. Das endgültige Pellet wurde in 500 µL rPBS resuspendiert und vor Licht geschützt bei 4 °C aufbewahrt. Die Bakteriensuspension wurde dann zur Durchflusszytometrieanalyse in rPBS verdünnt.

Die metabolische Markierung wurde wie oben durchgeführt, jedoch mit der Zugabe von unmarkiertem β-Cyclodextrin (218 µM, 436 µM, 872 µM und 1,74 mM) mit der CD-F-Sonde. Der Fluoreszenzpegel wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen.

Nach der oben beschriebenen Herstellung des Bakterienpellets aus der Stuhlprobe wurde eine Hitzevorbehandlung durchgeführt. Die Inkubation erfolgte 10 Minuten lang bei 65 °C, gefolgt von einer Abkühlung auf 37 °C, bevor die metabolische Markierung wie oben beschrieben durchgeführt wurde.

Vor der oben beschriebenen metabolischen Markierung wurde eine einstündige Inkubation in MM, ergänzt mit 0,1 % Glucose, durchgeführt.

Die DNA wurde aus allen Proben mit dem AllPrep PowerFecal DNA/RNA-Kit (Qiagen, Kanada) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. DNAs wurden mit der Qubit Fluorometrische Quantifizierungsmethode (Invitrogen) quantifiziert. Die V4-Region (basierend auf Escherichia coli) der 16S-ribosomalen RNA (rRNA) wurde für die Amplifikation durch PCR unter Verwendung des Vorwärtsprimers 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA und des Rückwärtsprimers 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT ausgewählt. Die Tags CS1 (ACACTGACGACATGGTTCTACA) und CS2 (TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT) wurden verwendet, um einen Barcode und Illumina-Adapter hinzuzufügen. Die Amplifikation wurde unter Verwendung von Q5 High Fidelity DNA-Polymerase (New England BioLabs) mit PCR-Zyklen wie folgt durchgeführt: anfänglicher Denaturierungsschritt von 98 °C für 30 Sekunden, vor 23 Zyklen von 98 °C für 10 Sekunden, 58 °C für 15 Sekunden und 72 Sekunden °C für 30 s, mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 2 min. Die MiSeq-Plattform wurde für die 2 × 250 bp Paired-End-Sequenzierung der resultierenden PCR-Produkte verwendet.

Die Sequenzierungsdatenanalyse wurde mit der ANCHOR-Pipeline48 durchgeführt. Kurz gesagt, die potenziellen Amplifikate wurden aus qualitativ hochwertigen Lesevorgängen zusammengestellt. Zusammengesetzte Contigs aller Längen wurden konserviert, um unerwartete Amplikonlängen zu kontrollieren. Dereplizierte Sequenzen wurden ausgewertet und Sequenzen mit einer Anzahl von mehr als 9 wurden als sichere Grundlage für die Analyse (Ankerschwelle) verwendet. Diese wurden verarbeitet und anhand von vier Hauptsequenzrepositorys (kuratierte NCBI-Datenbank für Bakterien und Archaea RefSeq, NCBI nr/nt, SILVA, Ribosomal Database Project) mit >99 % Identitäts- und Abdeckungsschwellenwerten kommentiert. Die α- und β-Diversität und -Ordination wurden mithilfe von R-Skripten mit der veganen Bibliothek analysiert und eine differenzielle Häufigkeitsanalyse wurde mit DESeq249 durchgeführt.

Shotgun-Metagenomikdaten für drei Proben (MX73_1, MX73_2 und MX73_3) wurden mit MicrobiomeAnalystR vorverarbeitet, einem R-Paket für die End-to-End-Datenverarbeitung, statistische Analyse und Visualisierung von Mikrobiom-Sequenzierungsdaten (https://github.com/xia). -lab/MicrobiomeAnalystR)77. Die metagenomische Vorverarbeitungspipeline von MicrobiomeAnalystR integriert fastp78, BBMap (https://escholarship.org/uc/item/1h3515gn) und Kaiju79, um Qualitätsprüfungen, Wirtssequenzdekontamination bzw. taxonomische Profilerstellung durchzuführen. Zunächst wurde Fastp zur Qualitätskontrolle, zum Adaptertrimmen und zur Qualitätsfilterung verwendet. Zweitens wurden menschliche Lesevorgänge mithilfe von BBMap entfernt, indem die gefilterten Lesevorgänge mit dem hg38.fa-Referenzgenom abgeglichen wurden. Abschließend wurde mit Kaiju eine taxonomische Klassifizierung der verbleibenden Lesevorgänge in der NCBI RefSeq-Datenbank durchgeführt.

Zuordnung von 16S-rRNA-Sequenzen zu metagenomischen Reads. BBduk (https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/bb-tools-user-guide/bbduk-guide/) wurde verwendet, um metagenomische Lesevorgänge (Länge 100 bp) auf 16S-rRNA-Sequenzen abzubilden ( Länge von ~290 bp) der 9 wichtigsten Mikrobenarten (wie in Abb. 3 dargestellt). Die Zuordnung wurde für die Vorwärts- und Rückwärtsablesungen für jede Probe unabhängig durchgeführt. Es wurde ein hdist von 0 festgelegt und es waren keine Abweichungen zulässig.

Die Isolate wurden anaerob (Atmosphäre: 87 % N2, 10 % CO2, 3 % H2) bei 37 °C über Nacht in BHI-Medien (Brain Heart Infusion) kultiviert. Die Übernachtkulturen wurden dann 1/250 in rPBS verdünnt und 10 µL der verdünnten Bakterien wurden in 240 µL Minimalmedium, ergänzt mit 0,1 % des entsprechenden Kohlenhydrats, inokuliert. Das Wachstum wurde in einer 96-Well-Platte beurteilt. Die OD600 wurde in einem Plattenlesegerät (EPOCH, Biotech) unter anaeroben Bedingungen gemessen und 72 Stunden lang alle 5 Minuten aufgezeichnet.

C. aerofaciens, B. wexlerae und A. communis erforderten modifizierte Medien und Bedingungen, um den Kohlenhydratverbrauch zu messen. B. wexlerae wurden über Nacht in Trypticase-Soja (TS)-Medium gezüchtet und Wachstumskurven wurden wie oben beschrieben erstellt. C. aerofaciens wurden über Nacht in Gam-Medien gezüchtet und das Wachstum wurde in MM getestet, das mit Hefeextrakt (20 mg/ml), Rindfleischextrakt (10 mg/ml) und 0,1 % des entsprechenden Kohlenhydrats ergänzt war. A. communis wurde 72 Stunden lang in Columbia-Medium gezüchtet, das mit 1,9 μM Hämatin, 6 μM Hämin, 15 μM FeSO4 und 200 ng/ml Vitamin B12, K1 und K3 ergänzt war. Um das Wachstum von A. communis über 96 Stunden zu messen, verwendeten wir die oben beschriebenen Columbia-Medien, jedoch ohne Stärke und Glukose. Anschließend wurden zuckerarme Columbia-Medien mit dem entsprechenden Kohlenhydrat in einer Konzentration von 0,1 % verwendet, um den Zuckerstoffwechsel zu messen.

Die Negativkontrolle bestand aus 250 µL MM, ergänzt mit 0,1 % Kohlenhydraten. Für jede Bedingung (N = 3) wurden drei Wiederholungen durchgeführt und die Wachstumskurven wurden in GraphPad Prism 9 erstellt.

DNA wurde aus 1 ml einer Bakterienkultur über Nacht extrahiert. Zur Extraktion der DNA wurde das One-4-All Genomic DNA Miniprep Kit (Biobasic) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Das 16S-rDNA-Gen wurde durch PCR amplifiziert und die Sanger-Sequenzierung wurde von Génome Québec durchgeführt.

Die gesamte bakterielle DNA aus dem Stuhl wurde mit dem AllPrep PowerFecal DNA/RNA-Kit (Qiagen, Kanada) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. DNAs wurden mit der Qubit Fluorometrische Quantifizierungsmethode (Invitrogen) quantifiziert. Die DNA wurde zur Illumina HiSeq 4000 PE 100 bp-Sequenzierung für die Shotgun-Metagenomik an Génome Québec geschickt.

Stuhlbakterien wurden wie oben beschrieben eine Stunde lang entweder mit GMP-F- oder NYST-F-Sonden markiert. GMP-F- oder NYST-F-markierte Bakterien wurden 5 Minuten lang auf einem FACSAria Fusion mit 4 Lasern und 18 Detektoren sortiert. Sortierte fluoreszierende Bakterien wurden sofort in eine anaerobe Kammer überführt. GMP-F-markierte Bakterien wurden 72 Stunden lang bei 37 °C auf BHI- und TSA-Blutagarplatten kultiviert. Nach der Inkubation wurden einzelne Klone auf BHI- oder TSA-Blutplatten isoliert und auf MM, ergänzt mit 0,1 % GMP, auf ihre Wachstumsfähigkeit untersucht. GMP-Consumer-Klone wurden durch Sequenzierung der 16S-rRNA mit den Primern 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG und 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT identifiziert.

Nach dem Sortieren wurden die NYST-F-markierten Bakterien in 5 ml ABB-Medium, ergänzt mit 0,1 % FOS (ABB-FOS), suspendiert und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100-µL-Aliquote der ABB-FOS-Kultur in 5 ml MM, ergänzt mit 0,1 % FOS (MM-FOS), überführt und 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Verdünnte Aliquots positiver Kulturen auf MM-FOS wurden dann auf ABB-FOS-, BHI- oder TSA-Blutplatten verteilt und 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Einzelne Klone wurden dann auf ABB-FOS-, BHI- und TSA-Blutplatten isoliert und auf ihre Wachstumsfähigkeit auf MM, ergänzt mit 0,1 % FOS, getestet. FOS-Verbraucherklone wurden durch Sequenzierung der 16 rRNA mit den Primern 27 F und 1492 R identifiziert. Fünf Milliliter frisches ABB-FOS wurden zu den verbleibenden ABB-FOS-Kulturen hinzugefügt und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Aliquote dieser Kultur wurden in 5 ml MM-FOS inkubiert und weitere Klone wie oben beschrieben isoliert. Insgesamt wurden fünf Passagen aufgeführt.

Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Es wurden keine Daten von den Analysen ausgeschlossen. Alle Replikate sind unabhängige biologische Replikate mit einem Minimum von n = 3. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 9.3.0 durchgeführt. Die statistische Signifikanz der Markierungsexperimente von K. oxytoca und L. acidophilus im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 1d) wurde durch einen ungepaarten t-Test mit dem Mehrfachvergleichstest von Bonferroni-Dunn bestimmt. Alle anderen Markierungsexperimente (Abb. 1, 2, 4 und 5) wurden durch eine einfaktorielle ANOVA mit Bonferronis Mehrfachvergleichstest ermittelt, bei dem alle Spalten mit der markierten Probe verglichen wurden. Die Differentialhäufigkeitsanalyse, die die ESV-Häufigkeit im Ausgangsstuhl mit den Glycan+-Proben in Abb. 3 vergleicht, wurde durch eine DESeq2-Analyse bestimmt und wird unter Verwendung des angepassten P-Werts dargestellt. Die Experimente waren nicht randomisiert, da alle drei Stuhlproben mit den drei fluoreszierenden Glykanen inkubiert wurden. Alle durchgeführten statistischen Tests sind in den entsprechenden Bildunterschriften aufgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten 16S-Sequenzierungs- und metagenomischen Sequenzierungsdaten wurden in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter dem Bioprojekt-Zugangscode PRJNA925842 hinterlegt. Die in diesem Artikel beschriebenen Sequenzen für isolierte Bakterien wurden in der NCBI-GenBank-Datenbank unter den Zugangsnummern hinterlegt: B. xylanisolvens CLD22001 (OP510057), B. angulatum CLD22003 (OP512543), B. caccae CLD22004 (OP512560), B. uniformis CLD22005 ( OP514970) und E. coli CLD22006 (OP514723). Die ANCHOR ESV-Sequenzen sind als separate Datei verfügbar (Supplementary Data 1). Quelldaten und statistische Details werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Forschung wurde durch einen Catalyst Grant (DO-16) des Canadian Glycomics Network (GlycoNet) an BC und CFM sowie durch den Zuschuss PJT-437944 des Canadian Institutes of Health Research (CIHR) an BC finanziert, und CFMBC hat einen kanadischen Forschungslehrstuhl der Stufe II inne ( CRC) in Therapeutischer Chemie. CFM verfügt über einen CRC der Stufe II in mikrobieller Darmphysiologie und ist ein Azrieli Global Scholar im Humans & Microbiome-Programm. JX verfügt über einen CRC der Stufe II in Bioinformatik und Big Data Analytics. Die Sequenzierung wurde an der McGill University und dem Genome Quebec Innovation Centre durchgeführt. Die Durchflusszytometrie wurde in der Flow Cytometry Core Facility des Life Sciences Complex der McGill University durchgeführt, die durch Mittel der Canadian Foundation for Innovation unterstützt wird. Die Aufnahme von Fluoreszenzbildern und das molekularbiologische Experiment (PCR und Nanotropfenquantifizierung) wurden mit der Ausrüstung der McGill University Imaging and Molecular Biology Platform (IMBP) durchgeführt.

Abteilung für Pharmakologie und Therapeutik, McGill University, 3655 Prom. Sir-William-Osler, Montreal, Quebec, H3G 1Y6, Kanada

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Canadian Centre for Computational Genomics, McGill Genome Center, 740, Dr. Penfield Avenue, Montreal, Quebec, H3A 0G1, Kanada

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Abteilung für Humangenetik, McGill University, 3640 University, Montreal, Quebec, H3A 0C7, Kanada

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Jasmine Chong & Jianguo Xia

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Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, McGill University, 3773 University Street, Montreal, Quebec, H3A 2B4, Kanada

Corinne F. Maurice

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LD hat die mikrobiologischen Experimente entworfen und durchgeführt. FA, OL, RK, RP und AM führten die Synthese und Charakterisierung der Sonden sowie vorläufige Aufnahmeexperimente durch. EG führte die bioinformatischen Analysen durch. JC und JX führten die metagenomische Analyse durch. BC und CFM konzipierten und betreuten das Projekt. BC verfasste das Manuskript mit CFM, LD, FA, OL und RK. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Corinne F. Maurice oder Bastien Castagner.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Dridi, L., Altamura, F., Gonzalez, E. et al. Identifizierung von Glykankonsumenten in Proben menschlicher Darmmikrobiota mithilfe metabolischer Markierung in Verbindung mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung. Nat Commun 14, 662 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36365-8

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Eingegangen: 14. Oktober 2022

Angenommen: 26. Januar 2023

Veröffentlicht: 07. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36365-8

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